如果您的实验室中存在支原体，请不要感到惊讶。它们存在于大多数细胞培养设施、组织培养实验室中，每个细胞培养师都必须处理这个问题。据估计，高达 60% 的细胞培养污染是由支原体造成的（Uphoff，2002 年）。

　　支原体被认为是最简单和最小的细菌之一。缺乏刚性细胞壁使它们对抗生素和抗菌药物（如青霉素和链霉素）产生抗药性。支原体可以通过过滤方法，因为它能够改变形状并且没有刚性细胞壁。在这里，我将介绍一些在支原体进入您的细胞培养物之前解决支原体污染的最佳方法，以及如果遇到支原体污染该怎么办。

　　支原体污染的原因

　　支原体通过各种难以追踪的来源进入细胞培养物。其中包括实验室人员、血清、细胞培养基、水浴、培养箱等。人类污染是上述污染的最大来源。污染物可以通过脏衣服、实验室服装、层流附近的人类讲话、人类头皮、打喷嚏、咳嗽等传播。此外，在任何保存细胞培养物的地方不断涌入的个人都会增加污染的风险。

　　由于实验室技术差，支原体可以通过交叉污染从这些来源传播。这些包括重复使用多个细胞系的移液器，而不是使用一次性的或重复使用手套。血清也是支原体污染的来源。由于其混浊性质，在最常用于每种细胞培养的血清中很难检测到污染。每次传代一次又一次地重复使用同一瓶血清可以促进支原体的生长。血清营养丰富，也是支原体增殖的最佳来源。另外，它是在高压灭菌后添加到培养基中的，因此不能保证血清是无污染的。

　　在层流中工作期间（说话或移液时）产生的气溶胶也是造成污染的主要原因之一。如果细胞系长时间暴露在空气中，这些产生的气溶胶将在继代培养过程中进入培养基或从空气中进入。气溶胶肉眼看不见，因此在导致污染之前无法检测到。

　　问题的另一个来源是用于继代培养的培养基，它有液体和粉末两种形式。由于处理不当或实验室技术不佳，支原体可以通过这种形式的粉末介质传播。过滤不能确保完全灭菌，因为支原体甚至可以逃脱 0.2 微米的过滤器。

　　图 1：污染！组织培养基中通常含有指示剂，指示剂会因微生物污染而降低 pH 值而变黄。Kaustubh Kishor Jadhav 摄。

　　支原体可以长时间保持干燥状态。当它们与营养源接触时，它们很快就会开始增殖。一旦它们出现在实验室环境中，就很难根除。您可以抑制支原体的生长，但不能完全根除它。当培养物中发现支原体时，丢弃烧瓶是一个不错的选择（除非培养物的来源不可替代或非常昂贵）。

　　检测支原体污染

　　用肉眼或光学显微镜检测支原体是非常困难的，那么你怎么知道它的存在呢？对于这项任务，您可以使用基于 PCR 的检测、DNA 染色、荧光标记、琼脂平板等。明智地选择下面列出的任何技术，并始终使用第二次检测以 100% 确定。在检测支原体之前，细胞应连续培养至少两周，以便有时间让低水平的污染物生长。对于测试，在采样前至少两三天不应更换培养基（Uphoff 和 Drexler，2011）。

　　在琼脂板/肉汤上培养被认为是检测支原体的“金标准”。在这种方法中，将细胞培养物的上清液添加到液体或半固体培养基（含有支原体生长所必需的营养物质）中。受感染的细胞培养物将在液体肉汤和琼脂板上都显示出生长。在琼脂板上很容易看到支原体菌落。该方法能够检测除少数支原体外的大多数支原体物种。

　　用于支原体检测的另一种方法是使用 PCR。在该技术中，使用了对各种常见感染支原体的 16s RNA 基因特异的 PCR 引物。广泛的引物涵盖了几乎所有的感染支原体。该过程中使用的引物要么是物种/基因特异性的，要么是通用的。这种方法快速、高效、可靠且具有成本效益（Sung，2006 年）。

　　基于传感器细胞的方法使用可以检测培养物中支原体存在的特殊细胞。一旦这些细胞检测到支原体，它们就会触发一系列化学反应，从而引起明显的颜色变化。该方法灵敏度高，但特异性低（Degeling，2012）。

　　生物发光检测试剂盒可从不同的生物技术公司获得，它们是基于酶的支原体检测试剂盒。这些试剂盒可检测真核细胞无法合成的支原体酶。首先，试剂盒的成分会破坏支原体，然后使用特定的酶来触发产生发光的细胞机制。然后可以通过光度计检测到。

　　可在受感染的培养基中加入非特异性 DNA 染色剂来检测支原体。在荧光显微镜下观察时，除细胞 DNA 外，支原体 DNA 以小簇的形式出现。

　　荧光 DNA 染色是另一种 DNA 染色方法。该方法使用 DAPI 和 Hoechst 33258 等 DNA 染料对所有 DNA 进行染色。此过程需要一定的专业知识，因为结果解释可能很困难。支原体的低密度、其他细菌的污染或这些细菌产生的细胞外荧光信号会阻碍正确的结果解释。此外，来自核区域的信号使支原体的检测变得困难（Ligasová，2019 年）。

　　预防支原体污染

　　避免支原体的最佳和最重要的方法是为在实验室设施工作的人员提供适当的培训和指导。这可以通过培训合格的员工进行细胞培养过程来完成，从而消除污染的原因之一。如果可能，应提供一个单独的实验室来进行细胞培养和细胞系的维护。为实验室设施提供这样的环境不仅可以减少支原体，还可以避免其他细菌和真菌污染。

　　适当的个人防护装备

　　由于人类是污染的主要来源，因此预防措施从您开始。如果你足够小心，为工作提供一个无菌的环境，它很快就会在你意识到之前变成一种习惯。这里有一些事情要做：

　　在处理细胞系时穿上干净的实验室外套和面罩。

　　避免在实验室与其他实验室成员讨论、打喷嚏或咳嗽。人的嘴里含有各种各样的支原体，当你说话、大笑、打喷嚏或咳嗽时，这些支原体会进入细胞培养物。

　　工作时戴上手套，使用后丢弃。当您不戴手套或口罩工作时，人际接触会传播污染。确保定期更换手套和口罩，而不是将它们放在实验室外套的口袋里。

　　为实验室准备单独的鞋子，以避免带入环境污染物。

　　细胞系和试剂

　　使用前检查您的细胞系库存是否有支原体污染。

　　确保用于继代培养的血清中没有污染。避免使用过期产品或存放时间较长的试剂。

　　尽可能使用新鲜培养基和密封紧密的培养基。

　　使用一次性移液器避免交叉污染。

　　确保在工作之前和工作期间将所有必需的设备和试剂保持在层流中。

　　在将细胞系用于测定或分析目的之前，执行支原体污染的例行检查。

　　使用 0.1 微米过滤器，因为它们是避免支原体的更好方法，而不是使用 0.2 微米过滤器进行介质过滤。无法 100% 保证此过程可以避免污染，但这是一种非常好的预防做法。

　　准备少量用于实验的培养基，防止污染其余培养基。

　　避免细胞培养物长时间暴露在空气中，并确保在将其放入培养箱之前拧紧烧瓶盖。这也将解决气溶胶污染问题。

　　在不使用抗生素的情况下进行培养，因为使用抗生素会使支原体对抗生素产生抗药性。抗生素只能用于去除支原体，不能用于防止支原体生长。此外，长期使用特定抗生素会导致对支原体以外的其他细菌产生耐药性。

　　始终以冷冻保存的细胞系小瓶的形式进行备份，即使冷冻保存的细胞的活力随着每次传代培养而降低。

　　设备

　　定期熏蒸层流和实验室设施。

　　用于维持细胞系的 CO 2培养箱不得过度拥挤（填充不超过其容量的 60%），否则会导致支原体从一个细胞系感染到另一个细胞系。

　　多个细胞系不应储存在一个培养箱中，因为它会增加交叉污染的风险。

　　应定期清洁 CO2 培养箱并避免任何类型的潮湿。为保持湿度而提供的蒸馏水应定期更换，因为支原体、细菌和真菌可能存在于这些容器中。

　　立即清理任何溢出的媒体或文化。

　　必须定期清洁水浴、液氮容器、试剂瓶和其他感染源，并定期检查污染情况。

　　检测后去除支原体

　　所以你发现了支原体污染，下一步怎么办？最好的方法是丢弃受感染的细胞培养瓶。在文化不可替代或非常昂贵的情况下，有一些方法可以拯救文化。

　　消除是一个非常耗时的过程，并增加了对其他健康细胞系二次污染的风险。支原体去除剂 (MRA) 是喹诺酮类抗生素的衍生物，是广谱抗生素。这些试剂可用于洗涤细胞培养物。根据感染的严重程度，治疗可能需要几周到几个月的时间。纤溶酶是一种广泛使用的药物，可以清除培养基中存在的大部分支原体。此外，BM Cyclin、氟喹诺酮环丙沙星、环丙贝、zagam、baytril、四环素等药物可用于从受感染的培养物中去除支原体。

　　MRA无毒，能有效去除大部分支原体污染，使用方便，对支原体范围广泛有效。这些方法不能保证完全去除支原体，但可以去除大部分支原体污染，是最后的选择。在考虑这种治疗时存在一些缺点，因为治疗的持续时间会影响细胞生长和活力。如果支原体对细胞培养造成永久性损害，则无法修复。一些细胞可能会因较长的潜伏期而死亡并影响总细胞活力。

　　结论

　　总而言之，防止污染而不是以后消除污染总是很重要的。当支原体感染您的细胞培养物时不要害怕，因为您不是第一个面临此类问题的人。尽可能教育他人，帮助他们了解防止污染的重要性。要注意和谨慎，而不是艰难地学习！

　　这篇文章由客座博主 Kaustubh Kishor Jadhav 贡献，他是米高梅生物科学与技术研究所的研究助理。