1. 如何选用特殊细胞系培养基？

　　培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。

　　2. 何时须更换培养基？

　　视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上的更换时间，按时更换培养基即可。

　　3. 可否使用与原先培养条件不同的培养基？

　　不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用和原先提供的培养条件不同的培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。

　　4. 可否使用与原先培养条件不同的血清种类？

　　不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

　　5. 何谓FBS, FCS, CS, HS ?

　　FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

　　6. 培养细胞时应使用5% 或10% CO2？或根本没有影响？

　　一般培养基中大都使用HCO3-/CO3 2-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时，则应使用5% CO2 培养细胞。

　　7.Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？

　　HBS和EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。

　　8. 什么是细胞的接种密度？

　　依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。

　　9. 悬浮性细胞应如何继代处理？

　　一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞的培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。

　　10. 冷冻管应如何解冻？

　　取出冷冻管后，须立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。

　　11. 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？

　　除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞)，在解冻之后，应直接放入含有10-15 ml新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。

　　12. 附着性细胞继代时所使用的trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？

　　一般使用的trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53 mM EDTA Na4。 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于-20 ℃，避免反复冷冻解冻造成trypsin 的活性降低，并可减少污染的机会。

　　13. 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？

　　回收动物细胞，其离心速率一般为300xg (约1 000 rpm)，5-10 分钟，过高的转速，将造成细胞死亡。

　　14. 细胞冷冻培养基的成份为何？

　　动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。

　　15. DMSO 的等级和无菌过滤的方式为何？

　　冷冻保存使用的DMSO 等级，必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4℃，避免反复冷冻解冻造成DMSO 的裂解而释出有害物质，并可减少污染的机会。若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO 的Nylon 材质滤膜。

　　16. 冷冻保存细胞的方法？

　　冷冻保存方法一：冷冻管置于4℃ 30~60 分钟→ (-20℃ 30 分钟*) → -80℃16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。

　　冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降1-3 ℃至-80℃以下，再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20℃不可超过1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤，接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。

　　17. 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？

　　冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。

　　18.培养基中是否须添加抗生素？

　　除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。

　　19. 应如何避免细胞污染？

　　细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染的血清和污染的细胞等。严格的无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好的细胞来源和培养基配制是减低污染的最好方法。

　　20. 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？

　　原则上：直接灭菌后丢弃之。

　　当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。

　　高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

　　(1)  在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。

　　(2)  分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/ml。

　　(3)  每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。

　　(4)  确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2～3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2～3代。

　　(5)  在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

　　(6)  重复步骤4。

　　(7)  在无抗生素的培养基中培养4～6代，确定污染是否以已被消除。