本文梳理了慢病毒包装的全部流程，并结合具体实例介绍了慢病毒包装的方法、步骤，并对包装过程中的关键点进行了细致的分析。使初学者也能握毫无障碍地自主完成病毒包装、纯化、滴度测定等实验。

　　（温馨提示：慢病毒包装过程中，遇到任何问题，或者对文章内容有疑问可随时与我们联系，亦可使用慢病毒包装试剂盒快速完成病毒包装。）

　　以293T细胞为例：

慢病毒感染293T细胞

　　1.293T细胞分盘

　　转染前一天，将已经长好的细胞以合适的比例传代到10cm培养皿中，当细胞长到80%时准备转染，步骤如下：

　　1）弃去培养液，加入5 mL 灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去 PBS 溶液。

　　2）用2 mL 胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞。

　　3）以含10%血清的培养基调整细胞密度为5 ×106个/10 mL，重新接种于10cm细胞培养皿中，37 ℃，5% CO2 培养箱继续培养，转染前细胞密度80%左右。

　　注意：293T细胞的状态非常重要，一般建议购买新的细胞株后分批多次冻存，以保证每次包装病毒时细胞的代数不会超过10代。同时尽量不要使用国产血清。复苏后的细胞需要传2代后才能进行病毒的包装，并且传达后18-24h需要密度达到80%左右。

　　2.转染前换液

　　转染前1~2h 将需要转染的细胞换新鲜的培养基，8mL/10cm皿。

　　注意：293T细胞贴壁性不是很好，换液时应小心滴加尽量避免冲起细胞。

　　3.转染

　　（1）以一个10cm平皿为例，取2个EP管，分别加入500 µl生理盐水，标记为A、B；

　　（2）A管加入60µg PEI，并充分涡旋混匀，B管加入过表达质粒和两个辅助质粒pSPAX2、pMD2.G，三质粒比例为4：3：1，共24µg；

　　（3）将A管PEI加入到B管中,轻轻混匀，静置20min；将混合液加入细胞中，过夜培养。

　　注意：质粒提取的质量，包括浓度和纯度。浓度至少要超过500ng/ul，因为浓度低，加入的体积就会相应增大，会增加细胞污染的风险。纯度可以使用核酸测定仪进行检测，260/280在1.8-2.0之间。有条件的可以选择去内毒素试剂盒进行提取，会对病毒的产量有帮助。同时，由于辅助质粒使用频率高，可以选择进行大提，分装低温保存，保证后续包病毒质粒的稳定性。

　　4.换液

　　转染过夜后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加10mL新鲜的细胞培养基继续培养。

　　注意：此时弃去的培养基中已含有少量的病毒，必须经处理后才能丢弃，所用的移液枪头等必须经消毒液浸泡至少15min后才能丢弃。

　　加入的新鲜培养基一般选择FBS浓度为2%-5%，可以根据细胞的生长状态来选择。

　　5.病毒收集

　　换液后48h，收集细胞上清液于50mL离心管，4度保存。并根据细胞生长状况适当补充新鲜细胞培养基（含2%-5% FBS的DMEM）。

　　24h后再次收集细胞上清液于同一个50mL离心管。4℃，4500g离心20min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管。过滤后的细胞上清液如果暂时不进行进一步处理，请及时于-80℃储存。

　　注意：细胞转染后24h就可以看到荧光蛋白的表达，48h可以进行荧光照片的采集，判断转染效率。一般为了能获得高滴度的病毒，需要通过不断优化条件，提高转染效率。优化条件包括：三质粒的比例优化，转染试剂的优化，细胞培养条件的优化等。

　　6.慢病毒的浓缩与纯化

　　病毒过滤后需进行浓缩，采用PEG8000方法浓缩病毒；

　　（1）5X PEG8000 —NaCl配制：称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭菌 30min；保存在4℃；

　　（2）每30ml过滤后的病毒初始液，加入5X PEG-8000 —NaCl母液7.5 ml；

　　（3）每20～30min混合一次，共进行3-5次；

　　（4）4度放置过夜；

　　（5）4度，4000 g，离心 20min；

　　（6）吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；

　　（7）加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；

　　（8）溶解后的病毒悬液分装成小份，保存于-80 ℃，避免反复冻融。

　　注意：试剂尽量选择sigma公司，同时需要保证配置的准确性。离心后可以直接看到病毒沉淀，吸走液体时要小心，不要吸走了沉淀。溶解时如果发现很难吹打，可以适当的静置一会再去吹打混匀。病毒溶解后需要及时分装保存，避免使用时反复冻融。

　　7.病毒滴度的测定

　　（1）将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔。放入37℃，5%CO2培养箱中培养；

　　（2）在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入900μl培养液，往第一个管中加入100μl病毒原液，混匀后，吸取100μl加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度，每个稀释度做4个重复孔；

　　（3）吸取96孔板中原有的培养基，加入稀释好的病毒液100μl；

　　（4）两天后在每个孔再加入100μl完全培养液，利于细胞的生长；

　　（5）第五天在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y*10）*1000/2/X孔的病毒液的含量（μl）。

　　注意：浓缩后的病毒可以适当将起始稀释度增大，避免病毒的浪费。条件允许的情况下可以每个稀释度多做些重复，保证实验结果的可靠性。病毒滴度是在293T细胞上测定的，不代表其感染其它细胞的能力。所以当病毒感染其它细胞时，需要多做几个MOI的梯度，以确保感染效果的最佳化。

　　8.案例图片展示

慢病毒感染SUNE细胞