细胞复苏是与细胞冻存相反的过程，即是细胞恢复生长的过程，是细胞培养技术中的核心环节！

一、细胞复苏基本步骤

1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化

2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀

3. 离心，1000rpm，5min

4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37°C培养箱静置培养

5. 次日更换一次培养液，继续培养

二、细胞复苏常见问题

1．细胞活力低或死亡

【可能原因】

l 冻存液质量差（如DMS0未预冷或污染）或配比不当

l 冻存前细胞状态差（如代次过高、未处于对数生长期）

l 解冻速度过慢或温度变化剧烈，导致冰晶损伤

l 冻存程序不当（如未使用程序降温盒直接放入液氮）

【应对方法】

l 选择优质冻存液（如预冷的有血清或无血清冻存液），避免DMSO局部浓度过高

l 冻存处于对数生长期的健康细胞（贴壁细胞汇合度约80%，悬浮细胞活力>90%）

l 快速解冻：将冻存管浸入37℃水浴，轻柔晃动使其在1~2分钟内全部融化

l 使用程序降温盒（以1°C/min降至-70℃后再转移至液氮保存）

2．细胞难以贴壁

【可能原因】

l 冻存前消化过度（胰酶作用时间过长或浓度过高）

l 复苏后离心速度过高或吹打力度过大，导致细胞破碎

l 培养条件不适宜（如二氧化碳浓度错误、培养基未预热）

l 微生物污染（如水浴时水渗入冻存管）

【应对方法】

l 冻存前控制消化时间，当80%细胞脱落后立即终止消化

l 低速离心（建议250-1000rpm，3~5分钟）并轻柔吹打细胞悬液

l 确保培养基与细胞类型匹配，预热至37℃，并检查二氧化碳浓度

l 严格无菌操作：用PE手套包裹冻存管水浴，复苏后酒精擦拭管口

3．细胞贴壁后生长缓慢或停滞

【可能原因】

l 冻存细胞密度过低或已进入衰老期

l DMS0未充分去除（对部分敏感细胞毒性大）

l 基因工程影响（如必需基因敲除或过表达产物抑制增殖）

【应对方法】

l 冻存时调整细胞密度至5x105~1x106个/mL，避免使用高代次细胞

l 离心去除冻存液中的DMSO，或直接稀释10倍后贴壁换液

l 对基因工程细胞（如敲除/过表达株），评估基因必要性或更换宿主细胞

4．细胞污染

【可能原因】

l 冻存管密封不严，水浴时液体渗入

l 操作环境或试剂污染（如支原体、细菌）

【应对方法】

l 冻存前检查管盖密封性，水浴时避免水面淹没管口

l 定期检测细胞及试剂微生物污染，对实验室进行过化氢熏蒸

5．操作失误

【可能情况】

l 解冻后未及时处理（冻存液长时间残留）

l 运输过程中温度波动（如未使用干冰或冰盒保冷）

【应对方法】

l 解冻后立即离心或稀释，减少DMSO暴露时间

l 远距离转移冻存管时，使用干冰或隔热容器维持低温