SDS-PAGE是我们研究人员熟悉的标准蛋白质分离技术，因为它是我们大部分时间所需要的。然而，这并不意味着其他方法不值得了解，其中一种技术就是等电聚焦。

　　等电聚焦（也称为 IEF 或电聚焦）是一种根据带电分子（通常是蛋白质或肽）的等电点 (pI) 分离带电分子的技术，等电点 (pI) 是分子没有总电荷时的 pH 值。

　　等电聚焦原理是什么？

　　等电聚焦之所以起作用，是因为当向带电分子施加电势时，带电分子将向带相反电荷的区域（电极）迁移。[1] 迫使这些分子通过固定的 pH 梯度迁移，它们也会迁移到带相反电荷的区域。

　　关键是，一旦分子到达与其 pI 匹配的固定化 pH 梯度区域，它将不再带电。因为它不再充电，所以它不再受到任一电极的电吸引。

　　同时对一堆分子执行此操作，它们都会向自己的 pI 迁移。因此得名：等电聚焦。

　　帮助！我不是物理学家

　　如果您需要更多帮助，可以从以下方面考虑：

　　pH 值低于其 pI 的分子将带正电荷（被相对酸性溶液质子化）。因此，当施加电场时，它将向带负电的电极（阴极）迁移。

　　pH 值高于其 pI 的分子将带负电荷（被相对碱性溶液去质子化）。因此，当施加电场时，它将向带正电的电极（阳极）迁移。

　　只要分子带电，迁移就会发生，它不会处于其 pI 状态。请记住，在 IEF 实验中，分子总是被迫通过固定化 pH 梯度 (IPG) 迁移。

　　准备 IEF 实验的关键组件

　　现在您已经掌握了等电聚焦理论，您可能想知道设置等电聚焦实验需要准备什么，对吧？您需要考虑两个主要事项：

　　1. 凝胶

　　您可以准备自己的 IEF 凝胶，但由于需要 pH 梯度，这样做非常冗长。这反过来又会引发更多错误。

　　因此，您可能只使用市售的 IPG 胶条。IPG 胶条由含有宽孔的丙烯酰胺凝胶组成，可防止分子因大小而发生任何分离。

　　有多种梯度范围可供选择。较宽的范围，例如 pH 3-10，适用于全蛋白质组分析，而较窄的范围，例如 pH 5-8，适用于更专业的应用。

　　2. 样品

　　IEF 样品通常与载体两性电解质溶液混合以帮助迁移。两性电解质只是一种水溶性分子，可以根据 pH 值同时充当酸和碱（就像氨基酸一样！）。两性电解质在凝胶基质中的轻松移动有助于样品分子与它们一起沿着 pH 梯度移动。朋友们！

　　同样，各种 pI 范围的两性电解质混合物是可商购的。

　　IEF的应用

　　那么等电聚焦如何真正帮助您进行研究呢？它的三个主要应用是：

　　1. 在 2D-PAGE 实验中与 SDS-PAGE 结合使用

　　等电聚焦传统上用作 2D-PAGE 实验中分离的第一个“维度”，其中分子首先通过其电荷分离，然后通过传统的 SDS-PAGE 进一步分离，这是分离的第二个维度。

　　有趣的事实！2D-PAGE 由两名研究人员于 1975 年独立开发和出版。[2,3] 那怎么样！

　　无论如何，两个维度的分离都是在同一个凝胶上进行的，但每个维度都是在彼此成 90°（垂直）的情况下进行的。因此，您可以通过一个方向的 pI 和另一个方向的分子量来实现分子的分离。

　　凝胶染色后，得到的图像称为电泳图。

　　由于样品基质中的两个分子不可能具有相似的 pIs和相似的分子量，因此 2D-PAGE 可以在一次实验中解析数千种蛋白质——足以可视化细胞器或细菌的整个蛋白质组。

　　2. 翻译后蛋白质修饰的检测

　　等电聚焦也可用于检查蛋白质的翻译后修饰 (PTM)，这些修饰往往会改变其 pI。例如，磷酸化、乙酰化和糖基化（实际上是大多数 PTM）都会增加蛋白质上带负电荷的原子的比例（在生理 pH 下），因此会降低其 pI。

　　当然，PTM 也会改变蛋白质的质量，但通常不足以被 SDS-PAGE 解析。

　　3. 质谱分析蛋白质和肽的分馏

　　IEF 的另一个用途是在质谱分析之前对蛋白质或肽进行分级分离。以前，很难回收通过 IEF 分离的分子。然而，使用安捷伦 OFFGEL 系统，蛋白质或肽保留在溶液中，而不是像标准 IEF 那样被困在凝胶中。[4]

　　以这种方式对蛋白质进行电聚焦提供了一种方便的替代 SDS-PAGE 的方法，用于在质谱之前进行样品分离。

　　使用 IEF 分离肽还提供了一种替代强阳离子交换 (SCX) 分级分离的方法，这是在质谱之前分离肽的更流行的技术之一。在某些情况下，与 SCX 相比，肽的 IEF 分离已被证明能从整个蛋白质组样品中鉴定出更多的肽。[5]

　　获得专业化的实际应用！

　　等电聚焦的更专业版本是毛细管 IEF (CIEF)。[6] 它本质上是相同的方法，但具有超高分辨率，因此它是准确确定蛋白质pI的好方法。

　　毛细管 IEF 用于各种医疗和诊断应用，例如促红细胞生成素的准确分析、单克隆抗体的质量控制以及作为糖尿病严重程度指标的血红蛋白电荷变异分析。

　　IEF 如何在实践中运作

　　建立等电聚焦实验可能比理解实际发生的事情背后的理论更容易！但基本步骤是：

　　IPG 胶条在变性缓冲液（>6 M 尿素）中面朝下再水化，其中含有一些洗涤剂，通常是载体两性电解质。对于许多样品，在样品中添加两性电解质效果更好，但最终这是一个反复试验的情况。

　　加载样本。有两种方法可以做到这一点：要么将其包含在补液缓冲液中，要么将其加载到条带末端的小塑料杯中。同样，某些示例在一种或其他加载方式下效果更好，因此请尝试一下，看看哪种方式最适合您。

　　然后将条带放置在 IEF 装置中，并将滤纸芯置于凝胶末端以收集 IPG 条带 pI 范围之外的盐和蛋白质/肽。

　　电极放置在顶部，然后您就可以运行了！

　　IEF 实验的合适电压很大程度上取决于所用 IPG 胶条的类型。因此，建议您在设置所有内容之前先做好功课并在手册中查找。（或询问实验室伙伴。）但无论哪种方式，请确保为您使用的条带类型使用正确的电压！

　　通常需要在夜间运行足够多的 IEF，所以去睡觉吧。然后，第二天，你可以回来继续你的研究的下一步。