虽然许多科学家有条不紊和精确，但我们中的一些人喜欢生活在边缘。通读协议？不，谢谢，我会抓住机会猜猜我应该使用什么浓度的 HCl。用正确的内容标记我的试管？Puh-lease – 仅凭“感觉”来演绎更令人兴奋的事情。作为对我们这些在飞行中茁壮成长的人的敬意，这里有 3 种方法的汇编，你绝对可以破坏任何破译可靠流式细胞术数据的机会。

　　你知道，如果你喜欢那种事情。

　　1. 补偿，Schmopensation

　　场景：您的染色方法无可挑剔，并且您选择了完美的荧光团。没有理由在分析中使用补偿控制。恭喜——这是确保您的双手充满可能不完全正确的流式细胞术数据的第一步！

　　原因？由于每个荧光团的激发而发出的光将落在波长光谱的某个位置。每个荧光团的发射光谱不同，有些光谱比其他光谱大。当两个发射光谱重叠时，您需要对重叠进行补偿以可靠地分析数据（我们自己的 Tim Bushnell 写了一篇关于光谱重叠和补偿的精彩介绍）。

　　如果您决定采取安全路线，请通过在激光上散布抗原来避免或至少尽量减少此问题。如果您正在查看 4 种不同的抗原，请将它们分散在紫罗兰色、红色和蓝色激光之间（如果可能），而不是让相应的荧光团都被紫罗兰色激光激发。这将最大限度地减少溢出量并减少可靠数据分析所需的补偿量。类似地，一些荧光团被不止一种激光激发，并可能导致高光谱溢出。唯一的补救措施：避免使用这些荧光团，并选择类似但更有选择性地激发的东西。

　　2. 自发荧光——天生如此

　　所有的细胞都很漂亮——有些甚至会发光！这种自发荧光主要是由于线粒体和溶酶体吸收了光并通过设计自然发射光。如此惊人的自然现象，如果忽略，还有另一种以“嗯？”结尾的方式。在你的分析过程中。

　　与显微镜检查一样，自发荧光会干扰流式细胞仪中特定荧光信号的检测，尤其是当感兴趣的信号非常微弱时。此外，自发荧光提高了在具有更大自发荧光的细胞类型中检测荧光团的阈值（例如，分别为巨噬细胞与 T 细胞）。

　　如果您想解决这个问题，请做一个完全的“正方形”，并始终使用您的实验样本运行未染色的对照。这将确保在您分析流式细胞仪数据时，您正在考虑您正在使用的任何通道中的任何自发荧光。

　　3. 二比一好

　　当我们不注意时，荧光分子喜欢欺骗我们。恰当的例子：许多荧光团被相同的激光和滤光片带宽激发（例如，GFP 和 FITC、APC 和 AlexaFluor647 等）。这不是一个真正的问题，直到您意识到您已经用 GFP 标记了您感兴趣的一种蛋白质，而另一种用 FITC 标记了。你怎么区分他们？幸运的是，这很容易！

　　开个玩笑，事实并非如此。事实上，你根本无法区分它们。你陷得很深，我的朋友。这是一个经典案例，确保您在草稿后返回染色面板，以确保您没有任何重复的荧光团潜伏在周围。话虽如此，如果您不想区分这两个标记，这种重复染色惨败可以派上用场，基本上创建了一个“转储”通道。

　　您肯定可以采取更多步骤来确保您的流式细胞仪数据最终进入“重做”堆，但是这 3 个技巧至少可以让您开始走向毁灭之路。