小鼠脾脏淋巴细胞悬液制备(小鼠脾脏淋巴细胞悬液制备)

　　材料

　　RPMI-5 或DMEM-5 完全培养基

　　新鲜分离的小鼠器官: ≤6 周龄的小鼠胸腺；6 周至6 个月龄的小鼠脾脏和淋巴结

　　60mmX15mm 培养皿

　　剪刀和镊子（保存在70％乙醇的烧杯中）

　　装有19G 针头的6ml 注射器

　　200μm 尼龙滤网

　　步骤

　　将新鲜分离的器官放入盛有3ml RPMT-5 或DMEM-5 完全培养基的60mmX15mm培养皿（每种器官一个培养皿）中， 用剪刀将器官剪碎。

　　用6ml 注射器的活塞将组织块向培养皿底面用力挤压直到仅剩纤维组织。

　　用装有19G 针头的6ml 注射器将组织悬液反复抽吸数次，以进一步粉碎组织团块。

　　将细胞悬液通过200μm 尼龙滤网滤入离心管中。用约4ml 完全培养基洗一次培养皿，如需要则重复一次，之后将洗液通过滤网加入离心管中。

　　在离心机中以1000r/min (200g) 离心10min 后弃上清 。用20ml 完全培养基将沉淀重悬后离心，再以适量培养基重悬以便计数 。

　　如果细胞不能立即处理，最好的保持细胞活力的办法是将细胞悬液置于冰块中。这种处理也能减少因细胞贴壁引起的细胞损失 。

　　如何去除脾脏细胞悬液中的红细胞？

　　脾脏细胞悬液在进行淋巴细胞计数之前最好先去除红细胞(RBC) 。胸腺和淋巴细胞悬液则不必去除红细胞。脾脏细胞的亚群分离也需先去除红细胞。

　　附加材料

　　ACK 裂解缓冲液

　　步骤

　　每个脾脏用约5ml 裂解缓冲液悬浮脾脏细胞；一个12ml 试管可用于裂解一个或两个脾脏，也可以用50ml 离心管裂解更多的脾脏。

　　室溫孵育5min ，间以摇动。

　　加入洗液直至装满容器，在低速离心机上以200g 离心10min 后弃上清。再洗沉淀一次并以适量培养基重悬以便下一步操作（如去除死细胞、细胞计数或者细胞分离）。

　　一步梯度法去除死细胞

　　下面介绍的方法，其基本原理是基于活细胞（密度较小）和死细胞（密度较大）密度不同，从而有助于将活的淋巴细胞与红细胞分离。

　　附加材料

　　高密度溶液：Ficoll-Paque (Ficoll 和泛影酸钠；Pharmacia LKB) 或Lympholyte-M(Cedarlane)

　　12ml 或50ml 聚丙烯离心管（比聚苯乙烯离心管好）

　　注： Ficoll-Paque 和Lympholyte-M 的密度与温度有关；该方法中所采用的以及其他商品化的高密度溶液适合在室温中使用。因此应注意使细胞悬液、离心和高密度溶液控制在室温。否则会因活细胞沉入离心管底导致在密度界面上损失活细胞。

　　步骤

　　用RPMI-5 完全培养基混悬细胞， 分装到离心管中使其细胞数达到 0. 5X10^8~ 1 X10^8个细胞／2ml (12ml 离心管）或 1X 10^8~ 5 X 10^8 个细胞／5 ml (50ml 离心管）。

　　用移液器吸取3ml （使用12ml 离心管时）或5ml （使用50ml 离心管时）高密度溶液， 将枪头伸到离心管底，缓慢将高密度溶液加入细胞悬液下方。

　　室温，800g 离心15min。为了取得好的分离效果，最好将离心机的”brake” 开关关掉。

　　使用5ml 移液器，沿高密度层表面缓慢移动移液器枪头， 吸入漂浮在高密度层上方的活细胞， 尽量少收集高密度溶液。将活细胞移入另一管中。

　　加入RPMI-5 完全培养基（少量细胞加入10ml , 细胞量较多时加入40ml) ，室温，200g 离心10min。重复一次。

　　以适量培养基混悬细胞以便进行下一步操作。