对于初学者，他们常常看中的是简单易学的流程，但对于在实际实验中多次碰壁的人而言，他们会看重每种实验方法中最关键的步骤/因素。接下来，本文将为大家总结 IF 实验的成功三要素，请尤为注意。

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　　随着研究的进行，你作出了一个假设，但得需要用免疫荧光(IF)来证实。接下来你需要作出一个选择：选择哪个抗体来获得可靠的IF结果呢？如何确认图像是否准确报告了靶标的位置？

　　验证的重要性

　　一抗，是IF实验的一个关键组分，其性能会直接影响实验结果的质量。一个抗体在蛋白印迹 (WB) 实验中能特异性检测到条带，并不足以保证其也能在IF中有效。在WB中，蛋白被置于严酷的还原/变性条件下从而结构发生了改变，因此被批准用于WB的抗体能检测到的表位在IF中很可能被隐藏或无法检测到，因为IF中，蛋白仍保留其天然状态。

　　验证特异性以免误导IF结果

　　α-Synuclein（α-突触核蛋白）在脑细胞中高表达，其功能异常会导致神经退行性疾病，如帕金森病。在健康组织中，α-Synuclein一般位于突触前末梢，并在此结合突触囊泡。Cell Signaling Technology(CST) 科学家将 α-Synuclein (D37A6) XP® Rabbit mAb #4179（Application：WB、IP、IF、IHC） 和另一知名公司的 α-Synuclein 抗体做了平行比较。两种抗体在WB中的性能与预期一致，但在IF中，在中脑区观察到 #4179 的斑点染色结果与 α-Synuclein在突触前区的位置一致，而另一家公司的抗体则显示点状分布不明显，甚至错误报告为胞核或胞体染色（箭头）。

　　注：各抗体使用均按照原厂家的推荐稀释比和流程进行的。

　　图1：结果显示，在WB中特异检测出清晰干净的条带，并不能充分确保该抗体在IF分析中也有良好性能和可靠性。使用 α-Synuclein (D37A6) XP® Rabbit mAb #4179 或另一知名公司的 α-突触核蛋白抗体对小鼠和大鼠脑细胞的提取物进行WB分析（左图），表现均佳。使用CST的 #4179（右图上排）或另一知名公司的抗体（右图下排）对小鼠中脑下部和海马体切片进行共聚焦IF分析。白色箭头表示用另一知名公司的抗体后被错误标记为 α-突触核蛋白的胞体/胞核。

　　这项实验说明了应用特定验证的重要性。CST所有抗体的每一个推荐应用，均是在实验室经过了严格交叉验证的。

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　　假设现在你已选好了抗体，也已进行IF预实验，并且蛋白定位也似乎合理。但你如何确定你获得的IF数据就能代表真正的生物现象呢？接下来介绍两个实验对照例子。

　　实验对照

　　加入合适的对照是非常重要的，它可以帮助确认样品之间的唯一变化是否在实验变量范围内，以及包括抗体在内的试剂是否如预期一样起作用。实验对照包括药物学处理、添加胞外配体来调控信号转导通路，或比较基因表达（敲除、siRNA等）不同的细胞。使用的对照类型取决于实验类型。在接下来的几个部分，我们提供了CST科学家在 IF-IC 中评估抗体性能时所采用的对照的例子，其中一些方法你可能想要用来确认对你细胞样本的特异性。

　　使用敲除型细胞系来验证靶标特异性

　　如果你正在研究某种有多个同工型的靶标，那么可以使用敲除型细胞系作为对照。比如，GSK-3α 和 GSK-3ß 两种基因会编码糖原合成酶激酶 (GSK-3)，它们在不同丝氨酸残基被调控。进行IF实验时，你可能想知道你正在使用的抗体是否能检测一种或两种同工型，还是都不能检测。这可以使用已知目的靶标表达呈阳性或阴性的细胞来确认。在下图IF实验中，使用野生型（GSK-3ß 阳性）、GSK-3α 敲除型（GSK-3ß 阳性）和 GSK-3ß 敲除型（GSK-3ß 阴性）小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 证明，GSK-3ß (D5C5Z) XP® Rabbit mAb #12456 可特异性检测正确的同工型。

　　图2：WB和IF分析证明 GSK-3ß (D5C5Z) XP® Rabbit mAb #12456 对 GSK-3ß 具有特异性：WB（左图）中，使用 #12456（上图）和 GSK-3α/ß (D75D3) XP® Rabbit mAb #5676（下图）对野生型、GSK-3α (-/-) 和 GSK-3ß (-/-) 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的提取物进行分析。在IF（右图）中，使用 #12456（绿色）对野生型 MEF（左图）、GSK-3α (-/-) MEF（中间）和 GSK-3ß (-/-) MEF（右图）进行分析。肌动蛋白丝用 DyLight™ 554 Phalloidin #13054 标记。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（DNA 荧光染料）。

　　通过调节靶标磷酸化状态来确认磷酸化特异性

　　对磷酸化、乙酰化、泛素化、剪切等翻译后修饰 (PTM) 具有特异性的抗体，可揭示有关靶蛋白生物功能的重要信息。在某些情况下，PTM 变化可能与表达和/或定位变化相吻合。因此，可以使用 PTM 特异性抗体以及酶或化学激动剂和/或抑制剂来调节靶蛋白的激活状态，从而确认细胞的 PTM 变化。

　　图3：实验干扰可确认某种抗体的 PTM 特异性。使用 Phospho-Cyclin D1 (Thr286) (D29B3) XP® Rabbit mAb #3300（绿色）对未处理的（左图）或用蛋白酶 MG-132 单独处理（中间）或用 MG-132 处理后再用 λ 磷酸酶处理（右图）的 HT-1080 细胞进行共聚焦IF分析。肌动蛋白丝用 DyLight™ 554 Phalloidin #13054 标记。

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　　固定和通透

　　最后同样重要的是，制备细胞或组织样品，这是决定实验成败的又一关键步骤。样品固定和通透是决定实验成败的又一关键步骤。理想的固定剂可以保留“栩栩如生”的样品效果，同时还会通过交联和抑制内源酶快速阻止自溶降解过程。以下提供了使用不同实验步骤时不同抗体会如何发挥最佳性能的例子。

　　在抗体开发中，CST 科学家测试了不同的方法，为你推荐最适合每种抗体的固定和通透实验步骤，因此，你无需不必要的摸索。

　　固定剂的选择

　　醛类固定剂如甲醛、福尔马林（一种甲醇比例较低的溶解甲醛的混合液）和戊二醛等都是最常用的固定剂。对多数抗体，CST 建议用 4% 甲醛固定（IF法标准实验步骤）。醛类会与细胞蛋白发生反应和交联，固化样品，并使之变得稳定。相比醇类，醛类更能穿透质膜并固定可溶性蛋白，但某些靶标可能会在醛交联中丢失自身的抗原性。

　　脱水/变性固定剂（如甲醇）会脱去细胞大分子周围的水，导致它们出现原位变性和沉淀。靶标蛋白变性可能会让通常隐藏的表位暴露出来，因此这种方法对某些抗体而言具有优势。但脱水固定剂不太适用于可溶性靶标及修饰状态特异性抗体，如磷酸化抗体。请参见说明书，了解最佳固定法。

　　对使用不同固定实验步骤固定的 HeLa 细胞进行平行比较，结果表明 Keratin 8/18 (C51) Mouse mAb #4546 最适合甲醇固定法。相比之下，AIF (D39D2) XP®Rabbit mAb #5318 则最适合甲醛固定法。

　　图4：使用 Keratin 8/18 (C51) Mouse mAb #4546（绿色，上排）或 AIF (D39D2) XP® Rabbit mAb #5318（绿色，下排）对经甲醛（左图）或甲醇（右图）固定的 HeLa 细胞进行共聚焦IF分析。红色 = Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087。

　　在进行多重实验时，我要使用哪些固定/通透条件？

　　如果使用需要不同 CST 实验步骤（IF法标准实验步骤与IF法甲醇实验步骤或IF法甲醇-通透实验步骤）的抗体进行多重实验，你可能需要根据最佳条件来确定使用抗体的优先顺序。在扩大你的实验前，先进行一次比较不同实验步骤的小型测试会更好。

　　去垢剂或醇类的选择

　　如果使用交联固定剂，则质膜将仍保持完整，这会使胞内靶标无法接触抗体。因此，应在交联固定之后进行通透，除非你的抗体是检测胞外表位。在 CST的IF法标准实验步骤中，在使用封闭步骤固定后，加入了 Triton® X-100 通透。Triton 和其他去垢剂（如 NP-40、TWEEN®、皂素、洋地黄皂苷和 DOTMAC）可去除细胞膜中的不同分子，形成大小不一的“孔”让抗体进入。

　　或者，也可在固定步骤之后，使用乙醇或甲醇进行醇类通透。这种方法结合了：交联固定剂的快速固定与中间物变性。这可以增强某些靶标的信号，尤其是与细胞器或细胞骨架相关的靶标。如下所示，甲醇通透可提升某些抗体的性能。

　　图5：PDI (C81H6) Rabbit mAb #3501 和 ß-Actin (8H10D10) Mouse mAb #3700 最适合甲醇通透法。使用 #3501（绿色）和 #3700（红色）对经 0.3% Triton® X-100（左图）或甲醇（右图）通透的 NIH/3T3 细胞进行共聚焦IF分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（DNA 荧光染料）。