细胞凋亡内容前面也介绍了几篇内容，相信大家对细胞凋亡的基本概念、细胞凋亡不同时期的主要特征及常用检测方法都有了一定程度的了解。本期，将为大家讲解TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和经验总结 。

　　一、TUNEL法的实验原理

　　细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。由此，TUNEL成为了检测DNA片段化（细胞凋亡）的最常用方法。（以下是TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光））

　　TUNEL检测：使用10 U/ml Dnase处理Hela细胞10分钟

　　二、TUNEL实验中关键步骤

　　1.充分脱蜡和水化。脱蜡可以先 60ºC 20 min，再用使用二甲苯两次 5-10 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；

　　2.把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用 10-30 min，几 μm 切片用短时间；几十 μm 切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。

　　3.适当延长 TUNEL 反应液的时间。一般是37ºC 1 h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至 2 h，但要结合你最终的背景着色。

　　4.DAB 显色条件的选择。一般 DAB 反应10 min 左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过 30 min；promega 公司提供的 DAB 液（桃红色），不利于辨认棕褐色，我不太喜欢。

　　5.PBS 的充分清洗。我个人认为，在 TUNEL 反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达 5 次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。

　　6. 此外，内源性 POD 的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。

　　三、细胞通透的时间选择

　　1.蛋白酶 k 的目的是通透细胞膜和核膜，从而使反应试剂充分进入细胞核进行反应，提高阳性率。但浓度过高或孵育时间太长容易脱片，只要不脱片，好像影响不大，其作用类似与 TritonX100 等细胞通透剂。

　　2. 蛋白酶K一般工作液浓度为 20 μg/ml,但浓缩液可配制1-10 mg/ml，可用 PBS 配制，也可用蛋白酶K缓冲液（100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA）；然后分装成小份，用完一支再用下一支，-20ºC保存 1 个月应该没问题的（重复拿的那支），而一直冷冻的至少可以用半年以上。

　　3. 蛋白酶K反应时间一般为10-30 min，具体时间长短与切片厚薄有关，4 μm左右的片子可以用 10 min，但30 μm左右的可用30 min，最终通过摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。

　　关键试剂操作条件

　　DAB 显色反应大约需要10 min，要控制好反应时间，勿使背景颜色过深。具体的可能还是得根据切片组织来源和切片厚度、试剂盒种类不同来摸索一下。

　　蛋白酶K工作液处理时间、温度须在范围内摸索，温度过高，时间过长，易破坏核酸结构，出现假阳性。

　　DNase 1 一般室温，10 min 即可。

　　四、如何减弱非特异性染色

　　若是肝脏或肾脏，因富含内源性过氧化物酶，需要增加过氧化氢浓度和延长孵育时间。其他还可以加强灭活、缩短 DAB 孵育时间、PBS 充分清洗，注意镜下把握好着色。

　　Tips

　　1.湿盒用带盖方盘，里面固定几根玻璃吸管用于放玻片，使用时稍加水即可。

　　2.英文说明书中对组织细胞通透这一步中，加了“对难处理的组织的处理”，意思是用常规方法处理（如蛋白酶 K)后，应该阳性而做不出阳性时，可用微波修复。

　　3.复染的目的是为了衬托组织形态结构，以利于结果分析，石蜡切片常用苏木素，核染成兰色，冷冻切片常用甲基绿，核染成绿色。

　　4.PBS 用蒸馏水、Na2HPO4、KH2PO4配制，现在有卖的，自己加蒸馏水稀释后即可用，很方便，也不贵。

　　5.蛋白酶 K 消化蛋白后，需要用封闭液。