免疫组化（IHC）作为一种经典的实验技术，已成为实验达人的必备技能之一。IHC的实验流程和方法并不难，但在实验过程中存在许多变量，容易遇到各种问题，因此，想要做出漂亮的实验结果并非易事，所谓“细节决定成败”。下面小编将简单介绍IHC的相关知识及在实验过程中经常遇到的问题和应对策略。

　　免疫组化(IHC)检测原理

　　那么什么是免疫组化检测？它的检测原理是什么？在进行深度剖析前，一些重要知识需要了解一下。免疫组化检测即抗原-抗体的特异性结合反应以及显色反应。通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、同位素、酶等）显色来检测组织切片中的抗原，从而对其进行定位、定性和定量。

　　显色常用的酶为辣根过氧化物酶（HRP），常用的显色底物为DAB（3,3’-二氨基联苯胺），偶尔用AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）。碱性磷酸酶（AP或AKP）也是目前最常用的标记酶之一，优点是稳定性好、灵敏度高。

石蜡切片免疫组化(IHC)实验流程

　　那么，怎样做出漂亮的染色结果呢？为了有一个全局概念，我们先来看一下石蜡切片免疫组化的实验流程吧！每一步都存在许多决定成败的小细节，它们可以是陷阱，也可以是获得好的实验结果的基石。

　　脱蜡水化

　　脱蜡水化的目的是使组织恢复到固定后的状态，暴露抗原以便与一抗结合。通常用二甲苯或二甲苯替代物脱蜡，再用乙醇梯度洗脱二甲苯。若脱蜡和水化不全会引起染色不均匀（如下图）、产生非特异性背景着色等问题。脱蜡不足是免疫组化失败的最常见原因，原则上要彻底、完全脱去切片上的蜡。

　　内源性过氧化物酶

　　许多组织中存在内源性过氧化物酶，它通过与DAB结合而着色。在一抗孵育前，一般用3%H2O2灭活约10~20min，避免内源性过氧化物酶造成假阳性结果。H2O2需现用现配，且4℃避光保存，否则易引起非特异背景（如下图）。H2O2孵育时间过长也会易引起脱片。部分组织还含有内源性碱性磷酸酶,可用左旋咪唑进行灭活。

　　抗原修复

　　由于组织在甲醛或多聚甲醛固定过程中会发生蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而掩盖抗原决定簇、失去抗原性。通过抗原修复，可以使细胞内的抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。抗原修复技术通常分为蛋白酶诱导的表位修复（PIER）和热诱导的表位修复（HIER）两大类。

　　在PIER方法中，蛋白酶K、胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶等蛋白水解酶可以使隐藏的抗原表位暴露，恢复其与抗体的结合。PIER的缺点在于恢复免疫反应性的成功率低，且有可能破坏组织形态和目的抗原。因此，需要选择性使用，严格控制浓度和作用时间。

　　HIER是在脱蜡入水后，将组织切片浸没在抗原修复液中并加热。修复液的主要成分为柠檬酸盐、三羟甲基氨基甲烷、去垢剂和螯合剂。最常用的修复液为pH 6~10的柠檬酸盐溶液和EDTA溶液。HIER对时间、温度、缓冲液和pH特别敏感，精确控制温度和时间是达到最佳修复的关键。总体来说，HIER的成功率比PIER高得多。

　　来源：病理柳叶刀