细胞计数法

　　实验方法原理：体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。

　　分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。

　　实验步骤：

　　一、消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。

　　二、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。

　　三、取出盖片，按下列顺序操作：

　　PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。

　　四、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。

　　五、计算

　　分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100%

　　BrdU参入法

　　实验方法原理：细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。

　　单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。

　　BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占1/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。

　　一、试剂配制

　　二、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10 μg/ml。

　　三、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1 μg。

　　四、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

　　五、常规染色体制片。

　　六、染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC 液，距紫外灯管6 cm处紫外照射30分钟。

　　七、弃去2×SSC液，流水冲洗。

　　八、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。

　　九、镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。

　　十、计算

　　细胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小时）

　　细胞周期（cell cycle)是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，分为间期与分裂期两个阶段。

　　1.间期

　　间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。

　　（1）G1期

　　此期长短因细胞而异。体内大部分细胞在完成上一次分裂后，分化并执行各自功能，此G1期的早期阶段特称G0期。在G1期的晚期阶段，细胞开始为下一次分裂合成DNA所需的前体物质、能量和酶类等。

　　（2）S期

　　S期是细胞周期的关键时刻，DNA经过复制而含量增加一倍，使体细胞成为4倍体，每条染色质丝都转变为由着丝点相连接的两条染色质丝。与此同时，还合成组蛋白，进行中心粒复制。S期一般需几个小时。

　　（3）G2期

　　为分裂期做最后准备。中心粒已复制完毕，形成两个中心体，还合成RNA和微管蛋白等。G2期比较恒定，需用1～1.5小时。

　　2.分裂期

　　细胞的有丝分裂（mitosis）需经前、中、后，末期，是一个连续变化过程，由一个母细胞分裂成为两个子细胞。一般需1～2小时。

　　（1）前期（prophase）染色质丝高度螺旋化，逐渐形成染色体（chromosome）。染色体短而粗，强嗜碱性。两个中心体向相反方向移动，在细胞中形成两极；而后以中心粒随体为起始点开始合成微管，形成纺锤体。随着核仁相随染色质的螺旋化，核仁逐渐消失。核被膜开始瓦解为离散的囊泡状内质网。

　　（2）中期（metaphase）细胞变为球形，核仁与核被膜已完全消失。染色体均移到细胞的赤道平面，从纺锤体两极发出的微管附着于每一个染色体的着丝点上。从中期细胞可分离得到完整的染色体群，共46个,其中44个为常染色体,2个为性染色体。男性的染色体组型为46，XY，女性为46,XX。分离的染色体呈短粗棒状或发夹状，均由两个染色单体借狭窄的着丝点连接构成。

　　（3）后期（anaphase）由于纺锤体微管的活动，着丝点纵裂，每一染色体的两个染色单体分开，并向相反方向移动，接近各自的中心体，染色单体遂分为两组。与此同时，细胞波拉长，并由于赤道部细胞膜下方环行微丝束的活动，该部缩窄，细胞遂呈哑铃形。

　　（4）末期（telophase）染色单体逐渐解螺旋，重新出现染色质丝与核仁；内质网囊泡组合

　　为核被膜；组胞赤道部缩窄加深，最后完全分裂为两个2倍体的子细胞。

　　在体内根据细胞的分裂能力可把它们分为三类：

　　①增殖细胞群，如造血干细胞，表皮与胃肠粘膜上皮的干细胞。这类细胞始终保持活跃的分裂能力，连续进入细胞周期循环。

　　②不再增殖细胞群，如成熟的红细胞、神经细胞、心肌细胞等高度分化的细胞，它们丧失了分裂能力，又称终末细胞（end cell）。

　　③暂不增殖细胞群，如肝细胞、肾小管上皮细胞、甲状腺滤泡上皮细胞。它们是分化的，并执行特定功能的细胞，在通常情况下处于G0期，故又称G0期细胞。在某种刺激下，这些细胞重新进入细胞周期。如肝部分切除术后，剩余的肝细胞迅速分裂。

　　流式细胞仪

　　实验方法原理：流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。

　　细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。

　　实验步骤：

　　一、取对数生长期细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，800 rpm，离心15 min去上清。

　　二、PBS洗2次，加0.5 mLPBS吹匀，务必吹散。

　　三、用5 mL注射器将细胞吸起，用力打入5 mL 70%(预冷)乙醇中，封口膜封口。4℃固定过夜（可长至2周）。

　　四、800 rpm 15 min收集固定细胞，PBS洗2次。

　　五、用0.4 mLPBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打（防止细胞破碎）。

　　六、加RNase-A约3 μL至终浓度约为50μg/mL ，37℃水浴消化30 min；

　　七、加PI约50 μL至终浓度约为65μg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。

　　八、用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，上机检测。

　　九、样品分析测定及打印。

　　常见问题

　　1.Q：胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查，取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？

　　A：以乳腺细胞的DNA含量测定为例，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加70%冰乙醇固定，要保证冰乙醇的最终浓度为50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时，最多可保存一个月，上机检测前再加PI综合染液。保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为5%.

　　2.PI分析细胞周期及凋亡率相关问题

　　Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配吗？

　　A：RNaseA用PBS配制没有问题，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。

　　Q：（2）测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶，可以一起检测吗？

　　A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定。

　　Q：（3）Triton－x－100是固定剂吧，用了70％的冷乙醇（是4℃吗？），是不是就不用Triton－x－100固定了？

　　A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定剂，可以用75％的乙醇于-20度固定。

　　Q：（4）还要设什么内参标准（5％鸡红细胞）吗？

　　A：对照肯定是需要的，这个根据自己的需要进行设置。

　　3.Q：流式检测细胞周期时加RNA酶所需的温度？

　　A：其实有关RNA酶在凋亡检测制样过程中使用的必要性问题尚有人持不同意见，该观点的人认为RNA酶在环境中无所不在，常规制样过程中所接触的试剂和环境中的RNA酶已足以降解样品中的RNA，所以为了简便实验操作，也有人不加RNA酶或如你所参考的方法将其与PI染液一起使用。不过经典的方法还是“先加RNA酶37度孵育30min，然后加PI 4度孵育30min”。至于染色时使用4度，是因为低温可减弱分子运动，增强荧光染料结合的稳定性和减少可能的荧光损耗。

　　4.Q：肿瘤细胞测周期。70％乙醇是否必须用PBS和乙醇配，用水配细胞会碎裂，PBS和乙醇配会出现絮状物？上流式前细胞用75％乙醇固定，使用瓶装75％乙醇是否可行？

　　A：先用冷PBS悬浮细胞，大约1-2ml，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入无水乙醇，终浓度为70-75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。乙醇固定之后没有细胞沉淀。

　　5.Q：流式分析细胞周期，收集了10的6次方细胞，但细胞在乙醇固定之后，还看到有细胞沉淀的，但PBS洗涤两次之后，就基本没什么细胞沉淀了，上机发现看不到细胞了。这是怎么回事啊？怎么解决这个问题啊？

　　A：很可能是洗细胞的过程中丢失了，解决办法有：

　　（1）尽量采用尖底的离心管和水平离心机

　　（2）离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒；吸上清时最好残留1mm左右的水膜，不要吸完。

　　（3）离心的转速或时间可稍微增加一点儿

　　（4）每次加抗体时，吸头最好不要接触液面；混匀时最好不要用吸头吹打，以免吸头挂壁带走部分细胞。