微生物生物量和生长曲线的测定实验原理

　　我们知道微生物都具有生长旺、繁殖快的特点，单细胞微生物如细菌、酵母菌的个体细胞的增大即细胞物质的增加是有限度的，细胞长大到 一定程度就开始分裂繁殖，菌体数量增多。细菌旺盛生长时几十分钟就可繁殖一代。

　　因此他们的生长往往是通过繁殖表现出来的，本质上是以群体细胞数目增加为生长标志。丝状微生物如放线菌、霉菌的生长主要表现为菌丝的伸长和分枝，他们相互缠绕，很难分清个体与个体之间的界限，所以通常以菌丝的重量增长(细胞质量的增加)或菌丝生长速度间接来衡量生长状况。目前测定微生物数量的方法有直接法和间接法。直接法包括血球计数板法、涂片染色法、比浊法等；间接法又包括平皿菌落计数法、液体稀释法、薄膜过滤计数法等。测定细胞物质量的方法有定氮法测、DNA法、测定细胞干重法、测定细胞湿重法、生理指标测定法等。

　　为了学习微生物的生长规律，增进了解微生物生长旺、繁殖快的特点，以酵母、放线菌和黄瓜枯萎病菌作为实验材料，本实验采用了干/湿重法、血球计数法直接计数、比浊法以及菌丝长度测量法,测定了放线菌及黄瓜枯萎病菌的生长量和黄瓜枯萎病菌的生长曲线，绘制了酵母生长标准曲线（细胞数密度-OD420）。

　　微生物生物量和生长曲线的测定实验试剂

　　培养基： 牛肉膏蛋白胨液体培养基(肉汤培养液)  高氏一号培养基(液/固)  马铃薯蔗糖培养基(PDA液/固)

　　试剂： 无菌水

　　微生物生物量和生长曲线的测定实验设备

　　震荡器

　　血球计数板(0.10mm  1/400mm2  16×25)

　　电炉

　　恒温培养摇床

　　普通离心机

　　超净工作台

　　恒温培养箱

　　手提式高压蒸汽灭菌锅

　　光学显微镜

　　721型分光光度计

　　比色皿

　　布氏漏斗

　　烘箱

　　打孔器

　　接种环

　　定性滤纸

　　直尺等

　　微生物生物量和生长曲线的测定实验材料

　　菌种：放线菌  酿酒酵母菌 黄瓜枯萎病菌

　　微生物生物量和生长曲线的测定实验步骤

　　1. 放线菌生物量测定

　　（1）菌丝的生物量测定——干/湿重法

　　将从土壤中分离出的放线菌在高氏1号平板上密集划线后，培养一周。用打孔器打下数个菌块，分别取3片菌块放入3瓶50ml/250ml高氏1号液体培养基中，1片菌块放入50ml/250ml无菌水中，30℃ 200rpm摇瓶培养一周后用定性滤纸过滤，收集菌丝，测出湿重后，将菌丝置于80℃烘箱中烘干至恒重，再测出的菌丝重量即为干重。

　　2. 黄瓜枯萎病菌生长量测定

　　(1) 菌丝长度测量法

　　通过测定菌落生长的直径来估测黄瓜枯萎病菌的生长速率。

　　挑一小块带黄瓜枯萎病菌菌丝的培养基接种于PDA平板中央，培养一周后用直径0.8cm的无菌打孔器打下接种至直径9.0cmPDA平板的中央，在接下来的一周内每隔12hours测量一次菌丝的生长长度，直到菌丝掩盖全皿为止。求出菌丝的平均生长速率，并据此绘制出生长曲线。

　　(2) 菌丝的生物量测定——干/湿重法

　　将培养一周的黄瓜枯萎病菌PDA平板用打孔器打下数个菌块，取3片菌块分别放入3瓶50ml/250ml PDA液体培养基中，1片菌块放入50ml/250ml无菌水中，30℃ 200rpm摇瓶培养一周后用定性滤纸过滤，收集菌丝，测出湿重后，将菌丝置于80℃烘箱中烘干至恒重，再测出的菌丝重量即为干重。

　　3. 酵母生长量测定

　　(1) 测定酵母细胞悬浮液的OD值——比浊法

　　将酵母接种至肉汤培养液(50ml/250ml)中，每瓶接一环，共2瓶，28℃ 125rpm摇瓶培养两周。将培养液分装入10ml离心管中5000r/min离心5～6min，弃去上清，再用无菌水重悬，离心并弃去上清，重复2次，以除去残留在培养液。

　　合并沉淀，用无菌水按一定比例稀释为6个稀释度，于420nm处测量OD值（721型分光光度计的有效测量范围为0.1-0.65）。

　　(2) 测定酵母悬浮液的细胞浓度——血球计数板计数

　　洗净血球计数板后将盖玻片盖在计数室上，用细口滴管将其中一个稀释度的菌液来回吹吸数次，使菌液充分混匀后立即吸取少量菌液加在盖玻片的边缘上，让菌液由盖玻片与计数板的缝隙间渗入计数室(计数室内不能有气泡)。轻压盖玻片，以免因菌液过多而将盖玻片顶起而改变了计数室的容积。

　　静置片刻，待菌体自然沉降稳定后，先用低倍镜寻找计数室的位置(视野宜调暗些)，找到后将它移到视野中央，再换高倍镜观察和计数。计数完毕后，洗净计数板。每个稀释度计数一次。

　　计数原则：为了减少误差，常取4个角上的4个中方格和中央的1个中方格计数，zui后取其平均值。另外：计上不计下，计左不计右，计数务必要有一定路径。

　　根据OD值与酵母细胞血球计数值绘制标准曲线图。

　　微生物生物量和生长曲线的测定注意事项

　　微生物的生长繁殖是其内外各种环境因素相互作用下生理、代谢等状态的综合反映，因此，有关生长繁殖的数据就可以作为研究多种生理、生化和遗传等问题的重要指标；同时，微生物在生产实践上的各种应用或人类对致病、霉腐等有害微生物的防治，也都与它们的生长繁殖或抑制紧密相关。

　　本实验方法有其显著的优点，也有一些不足之处：

　　1. 血球计数板是一种常用的微生物直接技术方法，具有直观快速、容易操作等优点，但费力，伤眼睛，且对菌悬液浓度要求高，一般不宜过低或过高(常大于10~6个/ｍ），OD值应在0.1-0.65之间，不易把握。而且此法不能测出活菌数，若选用台酚蓝等染色液,可使死细胞染为蓝色,活细胞不被染色，从而测出活菌数。

　　2. 湿重法和干重法可以体现发酵液中生物质的多少,但不能反映菌丝生理状态,衰老程度,甚至不能区分细胞死活。

　　3．对辐射生长的丝状真菌进行菌丝生长速率法衡量其生长状况来的简捷、方便，但似乎应用性不强。

　　因此，每种方法都各有优点和局限性，只有在考虑了这些因素同需要着手解决的问题之间的关系以后，才能选择较优者，或者几种方法同时并用。