将获得的组织细胞接种到培养瓶或培养板中的过程称为培养。组织块培养时，直接将组织块插入培养容器底部，几个小时后组织块即可贴在底部，再加入培养基。对于细胞培养，一般在接入培养容器前要对细胞进行计数，按要求接入一定量(以每毫升细胞数表示)的培养容器，直接加入培养基中。细胞进入培养容器后，立即放入培养箱，使细胞尽快进入生长状态。

　　应定期观察培养中的细胞，包括细胞是否生长良好，形态是否正常，是否有污染，培养基的PH值是否过酸或过碱(用酚红指示剂指示)，此外，还应定期检查培养温度和CO2浓度。

　　通常，细胞培养所需的主要仪器和设备如下:

　　AlphaClean1300清洁工作台

　　HF180二氧化碳培养箱

　　奥利巴斯倒置显微镜

　　Neofuge15离心机

　　细胞培养中常见问题的分析:

　　1.细胞死亡的可能原因:

　　答:如果是污染，最有可能是支原体。一般培养两周左右，细胞基本全部死亡；

　　b:血清浓度:浓度大于15%时，培养液呈淡黄色；

　　C: co，是否不足；

　　d:细胞传代次数过多，细胞老化；

　　2.PH值快速变化的原因:

　　答:二氧化碳的张力是错误的；

　　b:培养瓶塞拧得太紧；

　　c:缓冲系统的缓冲能力不足；

　　d:培养液中的盐浓度不正确；

　　e:。细菌、酵母、真菌等的污染

　　3.如何解冻冻结的试管:

　　取出冷冻管后，必须在37℃的水槽中快速解冻。轻轻摇动冻管，使其在1分钟内完全融化，注意水面不能超过冻管的盖边，否则容易污染。

　　冷冻管从液氮桶中取出解冻时，要注意安全，防止冷冻管爆裂。

　　4.细胞冻存管解冻培养时是否应立即去除DMSO:

　　除了少数特别标记为对DMSO敏感的细胞外，大部分细胞系(包括悬浮细胞)解冻后应直接放入装有10-15ml新鲜培养基的培养瓶中，然后每隔一天更换新鲜培养基以去除DMSO，从而避免大部分细胞解冻后无法生长或贴壁的问题。

　　5.我可以使用不同于原始培养条件的培养基吗？

　　不，每个细胞系都有自己的细胞培养基，这是专门使用的，并已适应。如果突然使用与最初提供的培养条件不同的培养基，大多数细胞不能立即适应，导致细胞衰竭。

　　6.培养基中一定要添加抗生素吗？

　　除特殊筛选系统外，在正常培养条件下，培养基中不得添加任何抗生素。

　　7.要离心一般的动物细胞，离心的速度是多少？

　　回收动物细胞，离心力约300xg(约1000 rpm)5-10分钟。如果转速太高，细胞就会死亡。

　　8.应该如何避免细胞污染？

　　细胞污染的类型可分为细菌、酵母、霉菌、病毒和菌丝体。造成污染的主要原因是无菌操作技术不当、手术室环境差、血清污染和细胞污染等。严格的无菌操作技术，洁净的环境，高质量细胞源和培养基的制备是减少污染的最佳途径。选用的CO2培养箱具有最好的高温消毒功能，一旦出现污染，可彻底消毒。有90℃高温湿热灭菌培养箱，如HF90培养箱，还有一种高端的180℃高温干热灭菌培养箱，如HF180 CO2培养箱。

　　9.能否使用与原始培养条件不同的血清类型？

　　不会，血清是细胞培养中极其重要的营养来源，所以血清的种类和质量会对细胞生长产生很大的影响。不同物种的血清在某些物质或分子的数量或含量上是不同的。误用血清通常会导致细胞衰竭。

　　10.培养细胞时应该用5%还是10%的CO2？还是一点作用都没有？

　　一般用HCO3-/CO32-/H作为培养基中pH的缓冲体系，培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养中应使用的CO2浓度。当培养基中碳酸氢钠的含量为3.7g/l时，10% CO2；应该用于细胞培养。当培养基中NaHCO3的浓度为1.5g/l时，应使用5%的CO2来培养细胞。建议使用HealForce HF90 CO2培养箱或其他知名品牌CO2培养箱。HF90 CO2培养箱具有高温灭菌功能，还具有自动启动CO2传感器自动校准功能，可提供稳定的CO2控制，均匀性好，有利于细胞培养。

　　1.一种冷冻保存细胞的方法:

　　保存方法一:将冷冻管置于4℃30 ~ 60min→(-20℃30min)→(-80℃16 ~ 18h(或过夜))→长时间保存在液氮槽中。

　　保存方法二:将冻存管置于程序降温机中，每分钟降温1-3℃至–80℃以下，然后放入液氮罐中长期保存(-20℃不宜超过1 H)，防止冰晶过大，导致细胞大量死亡。也可以跳过这一步，直接放入-80℃的冰箱，但存活率略有下降。

　　推荐HealForce HFLTP低温冰箱产品或其他一线品牌产品。HFLTP低温冰箱包括-86℃超低温冰箱，-40/-25℃低温冰箱和2-8℃冰箱，可以满足不同实验的需要。该产品具有温度稳定、占地面积小、冷却速度快等特点。

　　12.保存血清的最好方法？

　　建议血清保存在-5℃至-20℃(建议使用HFLTP 25(260)低温冰箱)。但是，如果储存在4℃，请不要超过一个月。如果不能一次用完一瓶，建议您将血清无菌包装到合适的无菌容器中，然后放回冷冻状态。

　　13.如何解冻血清才不损害产品质量？

　　建议您将血清从冰柜中取出，放入2 ~ 8℃的冰箱中融化(建议使用HFLTP 05(310)冰箱)，然后在室温下完全融化。但一定要注意的是，在融化过程中一定要定时均匀摇动。

　　14.血清解冻后发现絮状沉淀。如何处理:

　　出现血清沉淀的原因有很多，但最常见的是血清中脂蛋白的变性，而血清解冻后血清中也会存在纤维蛋白(形成凝血的蛋白质之一)，这也是产生沉淀的主要原因之一。但是这些絮状沉淀并不影响血清本身的质量。如果想去除这些絮状沉淀，可以将血清分装到无菌离心管中，400*g轻微离心，然后将上清液加入培养基中过滤。我们不建议您通过过滤去除这些絮状沉淀物，因为它可能会堵塞您的过滤膜。

　　15.为什么存放在冰箱里的胎牛血清会沉淀:

　　胎儿血清没有提前老化。在2-8℃保存时，各种蛋白质和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻连蛋白等。)可能会聚集形成沉淀或肉眼可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。胎牛血清建议-20℃保存(建议HFLTP 25(260)冰箱)，避免反复冻融。

　　参考资料:《组织培养与分子细胞学技术》，北京出版社。