细胞转染在基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，有着广泛的应用，是一种非常重要的研究和控制真核细胞基因表达的手段，今天主要和大家分享一下细胞转染技巧。

　　①从健康细胞开始

　　Ⅰ转染实验前，细胞解冻后传代3–4次。这使得细胞从解冻过程中恢复过来，并恢复正常的生长速度。

　　Ⅱ仅使用活性>90%的细胞——使用台盼蓝染色可轻松测定细胞活性。

　　Ⅲ定期传代细胞，切勿让细胞长到汇合状态或过度生长。如果让细胞长到汇合状态，可能会改变细胞的生长速度以及形态。

　　a.请在汇合率达到90%之前对细胞进行传代。我们建议您使用胰酶替代物Cellstripper™试剂(Corning25-056-CI)使细胞脱壁。Cellstripper™试剂可于室温下存储在通风橱中。可通过添加过量的Cellstripper™来跳过PBS洗涤的步骤，然后吸弃全部液体，仅留可覆盖瓶子表面的液体。

　　*非酶类细胞分离溶液，其配方是螯合剂的专利配方，可温和分离组织培养物的贴壁细胞。性质比胰酶更温和。

　　b.传代条件取决于所用的细胞系。部分经验法则：

　　对于快速生长的细胞，倍增时间为16小时(如HEK-293)，按1：10的比例分瓶。

　　对于生长缓慢的细胞，倍增时间为36小时(如原代细胞)，按1：5的比例分瓶。

　　Ⅳ保留冻存的细胞系，并定期解冻新细胞。传代次数高(>30–40)时，细胞的生长速度和形态会改变。

　　②进行实验之前，请先规划您的实验。

　　务必要熟悉实验方案、确定所需的材料量，并在开始实验前确认所需的一切物品条件均已齐备。

　　Ⅰ开始前，设计好铺板路线图，标注好每次处理或实验条件。

　　Ⅱ计算所需脂质体和DNA的储备量，并确认有足够的下列材料：TransfectGRO减血清培养基(Corning40-300-CVR)，Lipofectamine®2000或Lipofectamine®LTX试剂，以及DNA(0.5–1µg/µL)。

　　③转染时，请使用优质DNA。

　　Ⅰ使用无内毒素的试剂盒和实验方案制备DNA。

　　Ⅱ通过测量OD260/280值来确定DNA纯度，测得的OD值应介于1.7–1.9]之间。数值过高或过低均说明有杂质，不宜用于转染实验。

　　Ⅲ在无DNA/RNA酶的水或TE中稀释DNA。

　　Ⅳ制备的工作浓度为0.5–1µg/µL。可用SpeedVac®浓缩仪或透析过滤装置(例如，MilliporeAmicon®超滤管)来浓缩DNA。

　　④转染当天，将细胞铺板。

　　Ⅰ如果在转染前一天或更早时间铺板，转染效率可能下降。

　　Ⅱ转染时，细胞密度保持在汇合率为70–90%。

　　Ⅲ转染时，细胞密度影响转染效率。为了简化转染优化过程或节省时间，我们建议细胞铺成2种不同的密度，以确保较高的转染效率。

　　Ⅳ细胞的铺板和转染可同时进行，或者通过反向转染操作进行。反向转染操作中，使用的细胞是正常/正向转染的2.5倍以上。

　　Ⅴ转染复合物可以加到含抗生素和血清的培养基中，且不会影响转染效率。

　　⑤准备脂质体-DNA复合物。

　　Ⅰ为了获得最佳的试验结果，我们建议在TransfectGRO培养基中混合脂质体和DNA。另一种方法是使用无血清培养基。

　　Ⅱ在TransfectGRO培养基中稀释脂质体。在第二管Opti-MEM®培养基中稀释DNA，然后和等体积脂质体溶液混合。该2步稀释法可获得更优质的数据，比脂质体直接加入稀释的DNA中的方法获得的结果更有重复性。

　　Ⅲ脂质体一旦在TransfectGRO培养基中稀释，在加入稀释的DNA之前，最佳孵育时间为2-5分钟。稀释的脂质体孵育时间不要超过20]分钟。

　　ⅣDNA的TransfectGRO溶液更加稳定，最早可以提前4小时制备，但不要太早。

　　Ⅴ等体积稀释的脂质体和DNA溶液等体积混在一起后，通过缓慢地上下吹打来混合溶液，也可轻弹试管底部，或者快速涡旋混合。

　　Ⅵ脂质体/DNA复合物温育5-10小时后，将复合物转移到含有细胞和生长培养基的孔中。将复合物滴加到培养基上，然后轻轻地晃动板子。切勿剧烈地将孔中的脂质体/DNA复合物分散，否则会使细胞移位。

　　⑥利用含GFP或LacZ之类报告基因的质粒作为阳性对照，评估转染效率。

　　利用显微镜(例如FLoid™细胞成像工作站)或流式细胞仪(例如Attune®声波聚焦流式细胞仪)可轻松测定转染细胞和GFP蛋白表达细胞的百分比。可使用ToxBLAzer™试剂盒来测定LacZ基因的表达。

　　Ⅰ转染后24-48小时，应该可以看到或检测到质粒的表达。

　　Ⅱ阳性对照可以放在一个单独的孔中，或是与感兴趣的质粒共转染。共转染过程中，在加入稀释的脂质体之前，可在TransfectGRO培养基中将50–100ng带GFP的质粒和100ng感兴趣的质粒混合。