常用的细胞计数方法

　　一、原理：

　　细胞悬液制备后，需要计算悬液中所含细胞数量；一般以细胞数/毫升表示。因只有健康的细胞才有活力，接种后能够生长增殖，所以在接种关应先检查一下细胞的活力。

　　二、实验步骤：

　　1. 计数板

　　用96%酒精冲洗计数板后，用干净鹿皮擦净，另擦净盖片一张；把盖片覆在计数板上面，使之微微移向一侧，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液；

　　2. 染色

　　取吸管1 支，伸入培养瓶中，轻轻反复吹打细胞悬液使细胞重悬均匀后，立即吸细胞悬液少许，向另一离心管中滴入细胞悬液9 滴，再滴入台盼蓝染液1 滴，混匀，置2~3 分钟；

　　3. 加悬液

　　把计数板平放在显微镜台上，立即从计数板边缘轻轻滴1~2 滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖片间空隙中；

　　4. 镜检

　　镜下观察可见细胞分散各处，健康细胞胞体完整，透明不着色，凡着色细胞均为不健康者。计算四角大方格内的细胞数；压中线者只计算左线和上线者，右线和下线不计算在内（即仅计算压两个边的细胞）。

　　按下公式计算

　　5. 接种培养

　　通过计数测知悬液中细胞数后，可根据实验所需细胞数量向培养容器中接种。细胞接种数量随实验目的、血清含量和细胞生物性状而定；一般接种量在1~10x105细胞/毫升范围，实验周期短，希望细胞增殖较快时，接种量可大些。用含血清量大的培养液培养胚胎来源细胞、无限细胞系和恶性细胞系时，细胞接种数量不宜太大。

　　三、注意事项：

　　1. 向计算板中滴细胞悬液时要干净利落，勿令液面盖过盖片，加量要适当，过多易使盖片漂移，过少易出现气泡；不理想时应重做；

　　2. 镜下计数时，偶见有由两个以上组成的细胞团，应按单个细胞数计算，如细胞团数占10%以上，说明消化不充分；功细胞数少于200 个/10 平方毫米或多于500 个/10 平方毫米时，均说明稀释不当，需重新制备细胞悬液，再重计数；

　　3. 经常使用同一细胞在相同条件下工作时，对各种情况已做到心中有数情况下，可略去某些环节，如染色检查等；计算板计算细胞数法有一定误差，用作测定细胞生长曲线时，每一样品应重复计算4 次，取均值，较为可靠，若有电子细胞计数仪器当然更好；

　　4. 体外培养细胞在悬液中呈圆形，平均直径8~10 um，当被接种到底物上生长时，经过延展后，则呈扁形，在底物上所占的面积按直径算可达20~25 微米，则1cm2的底物上可容纳4~5 万个这样的细胞，这是理论上的数值，但在实际应用中，当细胞达到80%汇合状态时便应做传代处理，因此细胞数量比上述理论数量少。