似于基于3H-胸腺嘧啶核苷掺入的增殖测量，可以通过使用5-溴2'-脱氧尿苷（BrdU）（胸苷的合成核苷类似物）通过FCM监测细胞分裂。为此，将BrdU掺入新合成的复制细胞DNA中（在细胞周期的S期），并使用对BrdU特异的荧光素单抗检测掺入比例。Ab与BrdU的结合通常需要通过使细胞暴露于酸或热来使DNA变性。BrdU的测量通常与活性染料和/或DNA染色一起用于细胞周期分析。

　　尽管看似是一种简单的测定方法，但对于基于BrdU的细胞分裂检测，样品制备和DNA变性必须谨慎进行，因为处理太少会导致信号低，处理过多会影响DNA和所产生的信号 。样品需要洗净（至少三遍），因为任何残留的酸都会使检测到的抗体变性。此外，BrdU即使在4°C时也不稳定，因此必须新鲜使用。产生典型染色结果图如下（人PBMC用表面标记结合BrdU评估不同亚群增殖情况）：

　　步骤

　　用BrdU（~10μM）孵育细胞30–60分钟

　　在4°C、冰冷70％v/v乙醇中悬浮至少30分钟，固定和沉淀细胞（这样处理之后，最多可保存7天）。

　　离心去上清，用PBS洗涤一次后，在室温下与新鲜配制的2M HCl孵育30分钟（偶尔混合一下）。

　　用PBS洗涤细胞两次，然后用PBS-吐温（PBS，含0.1％w/v BSA和0.2％v/v Tween 20，pH 7.4）重悬。

　　将通过滴定实验确定的适量抗BrdU单抗添加至细胞悬液中，并在室温下避光孵育20分钟。（一定要注意避光，BrdU是光不稳定的）。

　　用PBS-吐温洗涤样品两次。如果第5步用的抗BrdU单抗是未结合荧光素的，则洗涤后还需要加入二抗，在室温下孵育20-30分钟。

　　用PBS洗涤后，将细胞沉淀与RNAse（50μL，100mg/ml）在室温或37°C下孵育15分钟。

　　通过FCM分析，每个样本至少收集10000个事件。

　　BrdU的替代品是修饰的核苷——EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷），与BrdU分析不同，EdU分析不是基于Ab的，因此不需要DNA变性，仅用温和的固定和去污剂的透化作用就即可结合DNA，并且其上面结合的荧光素能够发出足够高亮度的荧光。

　　大家可根据自己的科研条件，选择不同的方法。