简介

　　本方案实在在涂有胶原蛋白的培养皿内培养分离获得的胰腺泡上皮细胞。进而建立二维的聚集克隆，以便用于研究。 来源：动物细胞培养：基础技术指南第五版

　　原理

　　从豚鼠胰腺组织分离细胞，用纱布或尼龙网过滤细胞悬液，将过滤的细胞悬液轻轻加于BSA液上面。通过3次连续离心和混悬细胞，使呈团状的细胞分散。然后，将细胞接种于涂有胶原蛋白的培养器皿。

　　材料与仪器

　　F12K组织培养液含有20%小牛血清HBSS HBSS-DVC葡萄糖胰蛋白酶液胰蛋白酶液枸橼酸缓冲液凡枸橼酸三钠盐NaCl葡萄糖酚红胶原蛋白酶液溶解胶原蛋白酶硅化锥形瓶吸管 Blichner漏斗透析管Sidearm瓶聚丙烯离心管纱布培养皿

　　步骤材料

　　1.无菌

　　（1）F12K组织培养液：含有20%小牛血清（F12K-CS20)

　　（2）HBSS

　　（3）HBSS-DVC:不含Ca2+和Mg2+的HBSS

　　（4）葡萄糖（Difco,0155-174,BDBiosciences)

　　（5）胰蛋白酶液：用枸橼酸缓冲液配制0.25%胰蛋白酶液（1:250,Difco,BDBi-osciences)。枸橼酸缓冲液（pH7.6)含有3 g凡枸橼酸三钠盐、6 g/L NaCl、5 g/L葡萄糖和0.02 g/L酚红。

　　（6）胶原蛋白酶液：1800U/ml，用1XHBSS-DVC(pH 7.2)溶解胶原蛋白酶(GIBCO)。调整胶原蛋白酶液的pH至7.2，在4℃条件下用12Kda透析膜透析4 h，透析液为含有0.2%葡萄糖的HBSS-DVC。除去HBSS后，用HBSS-DVC重复此步骤16～18 h。过滤除菌，分装成10～20 ml，在70℃以下的条件下储存。

　　（7）25 ml硅化锥形瓶（Bellco)

　　（8）吸管：5或10 ml,大口径（Bellco)

　　（9）Blichner漏斗

　　（10）透析管（SpectroPor)

　　（11）Sidearm瓶:250 ml

　　（12）聚丙烯离心管：50 ml

　　（13）纱布

　　（14）涂有胶原蛋白的培养皿（Biocoat，BD Biosciences)

　　2.非灭菌

　　（1）水浴振荡器（M5B型，11-22-1，Backer)

　　（2）离心机

　　操作步骤

　　配制胶蛋白原酶和胰蛋白酶（1:2)混合消化液，加热至37°C。 2.在无菌条件下取出整个胰腺（0.5～1 g)，放人F12K-CS20中。

　　3.剪除肠系膜和其他组织，将胰腺切成1～3 mm小块。

　　4.将组织块移人盛有5 ml预热的混合消化液的25 ml硅化锥形瓶，在37℃条件下用水浴振荡器振荡消化（120r/min,15 min)。加人新鲜消化液，重复此步骤2～3次，直至大部分组织被消化分散。 5.每次振荡消化后，使大的组织块沉下，然后将上清液移入50 ml聚丙烯离心管。离心管盛有约12 ml冷F12K-CS20,以中和消化液。

　　6.离心（600r/min，5 min)后，用5～10 ml冷F12K-CS20混悬细胞，将离心管放在冰上。

　　7.收集细胞悬液，经数层灭菌纱布（放人Blichner漏斗内）过滤。在过滤过程中，将漏斗柄插入真空瓶，轻轻吸细胞悬液。取少量细胞悬液，做定量分析。

　　8.通常情况下，每毫克组织获得1X105～2X105个细胞，90%～95%细胞为活细胞。

　　9.将5X107～5X108个细胞加到2～4个50 ml聚丙烯离心管的液柱表面，每个离心管内盛有35 ml添加4%冷BSA的HBSS-DVC(pH 7.2)。然后，离心(600r/min，5 min)。此步骤对于有效地将胰腺的腺泡细胞与胰岛细胞、导管细胞和基质细胞分离是至关重要的。吸取上清液，重复此分离步骤2次，每次分离后收集细胞，用冷F12K-CS20混悬细胞。

　　10.用5～10 ml冷F12K-CS20收集细胞。取少量细胞悬液，计数细胞。每毫克组织获得2X 104～5X104个细胞，80%～95%细胞为腺泡细胞。接种密度为3X105个细胞/cm2。在72 h内，细胞贴壁，形成克隆。