细胞培养过程中操作不当时，易引发微生物污染。微生物污染一旦明确，多数将无法救治。为了防止污染的蔓延，还应及时丢弃污染细胞。

　　（1）霉菌和细菌污染

　　霉菌和细菌繁殖迅速，能在很短的时间内压制细胞生长或排出有毒物质杀灭细胞，因此霉菌和细菌污染较易发现。

　　霉菌污染后多在培养液中形成白色或浅黄色飘浮物，一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊，倒置显微镜下可见于细胞之间有纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培养液中；很多菌丝在高倍镜下可见到有链状排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。

　　细菌污染后培养液短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显混浊现象；有时静置的培养瓶液体初看不混，但稍加震荡，就有很多混浊物漂起；倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量细小的圆球状颗粒飘浮，有时在细胞表面和周围有大量细菌存在，细胞生长停止并有中毒表现。

　　（2）支原体污染

　　支原体污染是一个常见而又棘手的问题。支原体是一种大小介于细菌和病毒之间（最小直径0.2μm）并独立生活的微生物，因此可通过滤菌器，支原体对热敏感但对一般抗生素不敏感。支原体污染细胞后，培养液可不发生混浊，多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解，因此易被忽视。实际上细胞已受到各方面潜在的影响，如细胞变性、DNA合成受影响等。个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落。

　　为确定有无支原体污染可做如下检测：

　　①相差显微镜检测：将细胞接种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间，类似布朗运动。 ②荧光染色法：荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，据此可检测支原体。固定细胞以Hoechst 33258染色，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞周围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。

　　③电镜检测：用扫描电镜方法简便快速，也可以利用透射电镜。

　　④DNA分子杂交检查或支原体培养等方法：检出率高，但方法较复杂。

　　（3）病毒污染

　　传代细胞带有潜伏病毒。Hela-HPV18,HSV,逆转录病毒等以前病毒形式整合细胞DNA。可通过细胞直接观察（血细胞吸附、包涵体等）、动物接种、异种组织培养物生长、电镜观察、免疫学方法及PCR方法检查。

　　污染的预防

　　防止污染，预防是关键1、器皿准备中的预防2、操作前的预防：超净工作台，培养皿，培养液，操作者3、操作过程中的预防：瓶口不能于工作台风向逆向；火焰烧灼灭菌，专管专用，试管斜位，不要交谈，完毕后整理、清扫

　　污染排除

　　1、抗生素排除：联合用药，预防性应用比污染后使用更好

　　2、加温除菌：41oC，5~10h3、动物接种4、与Μφ共培养