细胞培养常见问题及其解决办法

　　1. 如何选用特殊细胞系培养基？

　　培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。

　　2. 何时须更换培养基？

　　视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。

　　3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基？

　　不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。

　　4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？

　　不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

　　5 何谓FBS, FCS, CS, HS ?

　　FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

　　6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？

　　一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞。

　　7.Hank's 蛋白酶(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank's 蛋白酶(HBS)和Earle's蛋白酶(EBS)有什么本质的功能差别？

　　HBS和 EBS 的主要差别在于氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。

　　8. 细胞之接种密度为何？

　　依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。

　　9. 悬浮性细胞应如何继代处理？

　　一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可，若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。

　　10.冷冻管应如何解冻？

　　取出冷冻管后， 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。

　　11. 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？

　　除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

　　12. 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？

　　一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20 °C，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低，并可减少污染之机会。

　　13.欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？

　　欲回收动物细胞， 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡。

　　14. 细胞冷冻培养基之成份为何？

　　动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。

　　15.DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？

　　冷冻保存使用之DMSO 等级， 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4°C，避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO， 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。

　　16.冷冻保存细胞之方法？

　　冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。

　　冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至–80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 °C 不可超过1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。

　　17. 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？

　　冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。

　　18.培养基中是否须添加抗生素？

　　除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。

　　19.应如何避免细胞污染？

　　细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染好方法。

　　20.如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？

　　原则上：直接灭菌后丢弃之。

　　当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。

　　高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如霉素b和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

　　1.在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。

　　2.分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，霉素b推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

　　3.每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。

　　4.确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2～3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2～3代。

　　5.在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

　　6.重复步骤4。

　　7.在无抗生素的培养基中培养4～6代，确定污染是否以已被消除。

　　21.支原体(mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？

　　不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。

　　22.支原体污染会对细胞培养有何影响？

　　支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。

　　23. 侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？

　　直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。

　　24. CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？

　　定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。

　　25.为何培养基保存于4 °C 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且pH值会越来越偏碱性？

　　培养基保存于4 °C 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2， 以调整pH 值。

　　26. 各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？

　　不同厂牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。

　　27. 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？

　　研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少， 大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤， 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心， 应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。

　　28.购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？

　　研究人员在细胞培养时出现存活率不佳， 常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80 °C 太久。

　　29. 收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？

　　冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。

　　30.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？

　　L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

　　31.GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？

　　GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。

　　GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。

　　32.什么培养基中可以省去加酚红？

　　酚红在培养基中用作PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。

　　33.如何用台盼兰计数活细胞？

　　用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/毫升，在0.1毫升细胞悬液中加0.1毫升0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色细胞是死细胞。

　　34.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？

　　丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

　　35.二价离子抑制蛋白酶活性吗？使用蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？

　　二价离子的确抑制蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制蛋白酶的活性。建议蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。

　　36.室温下配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用时PH值是多少？

　　缓冲液PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同PH值。

　　37.如何从T25瓶中转移sf9细胞？能用蛋白酶消化吗？

　　我们推荐使用脱落细胞的方法，此技术破坏性最小，生活力最高。通过使用巴斯德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰消化细胞。

　　38.胰消化一个T25瓶的sf9细胞：

　　1. 去除培养基。

　　2. 用2ml 1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除PBS。

　　3. 加入2ml 1x胰EDTA（恰好覆盖细胞表面）。

　　4. 37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。

　　5. 向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的FBS终止了胰的活性。）

　　6. 离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。

　　7. 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。

　　39.在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？

　　为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。

　　40.在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？

　　通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候计数时，都应该检查细胞活力。如果超过95％的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。

　　41.贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基，在放置几天后颜色变紫?

　　这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时，碳酸氢纳导致了pH值的上升。您可以在使用前松开瓶口，在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的pH值（确定松开瓶口以保证气体交换）。

　　42. 细胞培养基偶然被冻，可否继续使用？

　　如果细胞培养基偶然被冻，您应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基。

　　43. 无血清培养与有血清培养使用的抗生素量一样吗？

　　当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。

　　44. 培养基中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗？

　　一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

　　45.培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗？

　　大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。