无菌操作是决定细胞培养成败的关键因素，即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，操作不规范，也会导致污染。因此，所有操作都要最大可能的保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。
1、实验进行前：在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。
2、无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70% ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。细胞培养实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。
3、 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4、工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。
5、定期检测下列项目
（1）CO2 钢瓶的CO2 压力；（2） CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)； CO2 培养箱定期消毒；（3） 无菌操作台内气流压力是否正常，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。
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