TUNEL法的实验原理

　　细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。

　　由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。由此，TUNEL成为了检测DNA片段化（细胞凋亡）的最常用方法。（以下是TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光））

　　TUNEL检测：使用10 U/ml Dnase处理Hela细胞10分钟

　　TUNEL实验中关键步骤

　　1.充分脱蜡和水化。脱蜡可以先 60ºC 20 min，再用使用二甲苯两次 5-10 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；

　　2.把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用 10-30 min，几 μm 切片用短时间；几十 μm 切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。

　　3.适当延长 TUNEL 反应液的时间。一般是37ºC 1 h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至 2 h，但要结合你最终的背景着色。

　　4.DAB 显色条件的选择。一般 DAB 反应10 min 左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过 30 min；promega 公司提供的 DAB 液（桃红色），不利于辨认棕褐色，我不太喜欢。

　　5.PBS 的充分清洗。我个人认为，在 TUNEL 反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达 5 次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。

　　6. 此外，内源性 POD 的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。

　　细胞通透的时间选择

　　1.蛋白酶 k 的目的是通透细胞膜和核膜，从而使反应试剂充分进入细胞核进行反应，提高阳性率。但浓度过高或孵育时间太长容易脱片，只要不脱片，好像影响不大，其作用类似与 TritonX100 等细胞通透剂。

　　2. 蛋白酶K一般工作液浓度为 20 μg/ml,但浓缩液可配制1-10 mg/ml，可用 PBS 配制，也可用蛋白酶K缓冲液（100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA）；然后分装成小份，用完一支再用下一支，-20ºC保存 1 个月应该没问题的（重复拿的那支），而一直冷冻的至少可以用半年以上。

　　3. 蛋白酶K反应时间一般为10-30 min，具体时间长短与切片厚薄有关，4 μm左右的片子可以用 10 min，但30 μm左右的可用30 min，最终通过摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。

　　关键试剂操作条件

　　DAB 显色反应大约需要10 min，要控制好反应时间，勿使背景颜色过深。具体的可能还是得根据切片组织来源和切片厚度、试剂盒种类不同来摸索一下。

　　蛋白酶K工作液处理时间、温度须在范围内摸索，温度过高，时间过长，易破坏核酸结构，出现假阳性。

　　DNase 1 一般室温，10 min 即可。

　　如何减弱非特异性染色

　　若是肝脏或肾脏，因富含内源性过氧化物酶，需要增加过氧化氢浓度和延长孵育时间。其他还可以加强灭活、缩短 DAB 孵育时间、PBS 充分清洗，注意镜下把握好着色。

　　Tips

　　1.湿盒用带盖方盘，里面固定几根玻璃吸管用于放玻片，使用时稍加水即可。

　　2.英文说明书中对组织细胞通透这一步中，加了“对难处理的组织的处理”，意思是用常规方法处理（如蛋白酶 K)后，应该阳性而做不出阳性时，可用微波修复。

　　3.复染的目的是为了衬托组织形态结构，以利于结果分析，石蜡切片常用苏木素，核染成兰色，冷冻切片常用甲基绿，核染成绿色。

　　4.PBS 用蒸馏水、Na2HPO4、KH2PO4配制，现在有卖的，自己加蒸馏水稀释后即可用，很方便，也不贵。

　　5.蛋白酶 K 消化蛋白后，需要用封闭液。