原代细胞 (primary culture cell)是指从机体取出后立即培养的细胞。

　　原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株(系)研究、DNA，RNA和遗传学研究等，还可应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等。其在生物医药领域有不可替代性作用，市场前景广阔。

　　有人把培养的第1代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养。而它，也是建立细胞系的第一步。

　　原代培养

　　原理：

　　将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

　　仪器、材料及试剂：

　　仪器：培养箱（调整至37°C），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37°C）

　　材料：动物组织块

　　试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒

　　初代消化培养法：

　　准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

　　布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

　　处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

　　剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。

　　消化：或用恒温水浴，或置于37°C温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

　　分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

　　计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。

　　培养：置于36.5°C温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。

　　初代组织块培养法

　　剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。

　　摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。

　　轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5°C温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。

　　培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。

　　细胞传代培养是在原代培养成功之后，组织培养常规保种方法之一，也是几乎所有细胞生物学实验的基础。随着培养时间的延长细胞不断的分裂，当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。

　　传代培养可获得大量细胞供实验所需，它需要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。

　　传代培养法

　　原理

　　细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

　　材料和试剂

　　1.细胞：贴壁细胞株

　　2.试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）

　　3.仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等

　　操作步骤

　　1.吸除培养瓶内旧培养液；

　　2.向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限；

　　3.置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化；

　　4.吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液；

　　5.用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液；

　　6.计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。

　　无菌操作注意事项

　　1.操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试，试剂等瓶口也要擦拭；

　　2.点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜；

　　3.操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会；

　　4.不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理；

　　5.瓶子开口后要尽量保持45°C斜位；

　　6.吸溶液的吸管等不能混用。