开学季也是细胞们的复苏季，如果你对于细胞复苏还没有做到胸有成竹的话，快收藏这篇文章，在每一次复苏前都温习一遍吧。

　　细胞复苏就像是蛋炒饭一样，最简单也最困难，只要有一步差池，就会导致细胞受损乃至死亡，从而整个实验失败！

　　细胞复苏的第一要点就是快速融化，要尽可能快的将细胞从-178℃解冻至37℃，尽可能避免冰晶缓慢融化时进入细胞再形成结晶，对细胞造成损伤。

　　具体操作流程共有八个步骤：

　　①　操作准备

　　1) 将无菌超纯水加热至37℃保存在无菌玻璃瓶中备用；

　　2) 细胞实验室预先常规消杀，用紫外线照射30min以上，并用75%酒精擦拭超净台以及各类器材，保证操作环境无菌；

　　3) 将各类需要使用的枪头、离心管、培养瓶以及废液缸等高温高压灭菌后有序摆放在超净台桌面。

　　②　细胞转移

　　1) 根据细胞冻存时保存的编号确定细胞存放的位置；

　　2) 穿好防护设备后将细胞从液氮中取出，核对细胞编号；

　　3) 将细胞迅速转移至操作空间，如步行距离超过1min，需准备干冰运输。

　　③　细胞解冻

　　1) 迅速将细胞冻存管投入37℃的无菌超纯水中快速摇晃解冻；

　　2) 解冻1-2min后等液体完全溶解后，用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再放入超净台内。

　　④　离心清洗

　　1) 将细胞溶液加入完全培养基完全吹打混合后平衡；

　　2) 将离心管以3000r/min，离心3min，重复清洗两次去除DMSO。

　　⑤　悬液制作

　　1) 将上清液弃去后重新加入10ml完全培养基；

　　2) 通过移液枪完全吹打混合后制成细胞悬液。

　　⑥　计数观察

　　1) 取适量悬液进行染色计数，计算细胞活力、活率；

　　2) 显微镜下观察细胞，确定细胞具体复苏情况

　　3) 细胞浓度需保持在5*105为适宜。

　　⑦　培养细胞

　　1) 将观察过后适宜培养的细胞分装在各个培养瓶中；

　　2) 将各个培养瓶标记后放入37℃，5%CO2培养箱内24-48h后换液或传代。

　　⑧　记录时间

　　1) 将培养瓶中的细胞记录时间，方便之后换液传代记录。

　　细胞复苏小贴士TIPS:

　　1. 操作液氮时需要做好完全防护措施，避免直接接触到液氮造成伤害。

　　2. 取出冻存管后需要检查是否密封，如果密封不完全会导致液氮进入管内解冻时出现炸管情况。

　　3. DMSO在常温下会对细胞产生毒性，解冻要迅速，解冻后需要尽快加入少许培养基稀释后离心。

　　4. 每次移液后需要更换枪头，避免造成溶液交叉污染。

　　5. 解冻前后的培养基血清需要保持一致，如有更换需要进行梯度更换。

　　判断细胞复苏的成功的关键，就是看细胞复苏后的存活率以及之后的生长情况，以贴壁细胞为例，复苏后细胞贴壁率能达到95%以上，就说明细胞活性好，复苏操作流程达标。