稳定转染细胞株可应用于重组蛋白、抗体生产、基因编辑、功能性研究和移植瘤构建等多种实验，已成为我们日常实验操作的一部分。但是很多同学也会一直为这个实验愁眉苦脸，遇到加入慢病毒后细胞状态差或者死亡、GFP的亮度弱转染效率低下的问题。整个慢病毒转染实验周期耗时长，对后续实验影响大，下面笔者提供一份慢病毒转染全攻略，助你在慢病毒转染实验中乘风破浪。

　　一． 慢病毒包装

　　慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1作为基础发展起来的基因治疗载体，具有能稳定表达外源基因、感染谱广泛、有效感染处于分裂期和静止期的细胞等优点，成为导入外源基因的有效工具。慢病毒已被广泛应用到各种细胞系基因过表达、RNA干扰、miRNA研究以及活体动物实验中。

　　慢病毒包装过程一般为构建慢病毒表达载体、大量扩增慢病毒载体、在293T细胞内进行慢病毒载体的大量包装、慢病毒的浓缩及纯化、慢病毒滴度测定。但现在笔者所在的高校很多课题组已经不再个人进行这个实验了，一般都直接从公司购买测定好滴度的慢病毒。笔者提供一篇文献：PMID: 30505888，里面详细描述了整个慢病毒包装的实验材料和步骤，可供大家参考。

　　二．慢病毒的储存与稀释

　　1. 病毒液储存：如果短时间（3天）内进行实验，可以将病毒液暂放置4℃保存；如不能在短期内全部使用，需将慢病毒液分装后置于-80℃冰箱保存（根据每次的使用量进行分装，将定量的病毒液置于冻存管中，做好日期和储存量标记，封口膜密封）。病毒液可存放于-80℃冰箱约6个月，如储存时间超过6个月，可在使用前重新测定病毒滴度。

　　2. 病毒液稀释：将病毒液取出，置于冰上融解，使用PBS或培养目的细胞的无血清培养基稀释。

　　三．慢病毒感染细胞实验步骤

　　慢病毒对不同细胞系亲嗜性不同，在使用慢病毒前可以查阅相关文献，了解慢病毒对目的细胞系的感染复数MOI值（MOI在用于病毒感染细胞的研究中时，含义是感染时病毒与细胞数量的比值）。如果无相关文献支持，可以通过预实验获取合适的MOI值。

　　以24孔培养板为例，进行目的细胞系和293T细胞（平行对照）的感染预实验，按照不同的MOI值设置若干感染孔（可依据经验值设置3个左右梯度），并根据MOI值和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。

　　(1) Day 1，准备细胞：在 24 孔培养板接种若干孔处于对数生长期的目的细胞和平行对照293T细胞，铺板时细胞融合率为50%左右，每孔加入100 μL培养基，培养箱中培养至细胞贴壁（针对贴壁细胞），进行病毒感染时细胞的最佳融合度为 70% 左右。

　　(2) Day 2，准备病毒: 4°C保存的病毒，取出后轻轻用移液器混匀; -80℃冻存的病毒在冰上融化后使用。

　　接着感染目的细胞：从培养箱中拿出细胞，观察细胞生长状态，如细胞状态好（细胞状态对转染影响较大），则可以开始实验。

　　a.吸去培养器皿中的旧培养基，用PBS清洗两次，更换新鲜培养基（如果细胞生长良好，没有大量漂浮细胞，培养基没有变色，则不用换液）。

　　b. 使用移液器吸取准确体积的病毒液加入目的细胞和对照细胞中。

　　c.将病毒液和培养基混匀，放于二氧化碳培养箱(37℃、5%CO2)孵育培养。

　　(3) Day 3（加入病毒液 24 小时后），弃去含病毒的培养液，换上新鲜完全培养液，继续在培箱中进行培养（该时间可根据实验情况具体调整，笔者所在课题组为8小时换液）。

　　(4) Day 4（加入病毒 48-72小时后），对于带 GFP 报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观测 GFP 荧光强度，对于携带 Puromycin 抗性基因的病毒，换上含适当浓度Puromycin完全培养液（Puromycin 标准终浓度范围为 1-10 μg/mL，不同细胞系Puromycin工作液浓度不同，可查阅文献或者预实验寻找最适Puromycin筛选浓度），筛选出稳定表达的细胞株。

　　(5) 稳定细胞株筛选：将Puromycin筛选后的细胞进行传代，并继续持续施加合适浓度Puromycin 维持抗性，连续筛选并传3代后，冻存保存稳定表达细胞株。

　　四．慢病毒感染注意事项

　　1. 进行病毒操作时最好使用专用生物安全柜，避免污染。

　　2. 必要时可使用病毒感染增强剂来提高病毒感染效率（Transdux），笔者所在课题购自SBI（https://systembio.com/shop/transdux-max-lentivirus-transduction-enhancer/）。

　　3. 在转染后，如果目的细胞系GFP荧光强度弱，可观察293T平行对照组荧光强度，如果293T荧光强度也弱，需要考虑病毒液本身的问题，如果293T荧光强度正常，就需要考虑是不是目的细胞系属于难转染细胞系等其他原因。

　　4.在转染过程中常常遇到加入病毒液后或者加入Puromycin筛选后细胞状态极差的情况，这个时候细胞通常比较脆弱，在已经确定好病毒液的量或者Puromycin筛选浓度时，多考虑是不是在转染时细胞本身状态不够好（比如笔者遇到过传多代的细胞会难转染的情况）。

　　5.如果加Puromycin后细胞死亡较多，需要及时换液，以防死细胞释放的有害物质影响具有抗性的细胞生长。

　　6.像HepG2细胞具有聚集生长的特性，如果加Puromycin后死亡的细胞较多，剩下的HepG2细胞比较稀松，细胞也很难长起来。