在做Western Blot实验时，明明感觉自己已经严格按照步骤方法做的很好了，然而却为什么的不到自己满意的结果呢？其实每个人的实验习惯千差万别，只要掌握一些标准化的要领，小白也能独立的完成Western Blot实验。因此，针对Western Blot实验中可能出现的问题，我们做了一个比较细致的分析，相信这些能够帮助你更容易获得满意的结果。

　　1.高背景问题的原因及解决办法

　　①抗体浓度太高

　　答：优化/降低一抗和二抗的浓度

　　②抗体孵育温度过高

　　答：4 ℃孵育

　　③二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应

　　答：设置二抗对照（不加一抗），降低二抗浓度

　　④一抗或二抗与封闭剂有交叉反应

　　答：在孵育和洗涤液中加入 Tween-20 减少交叉反应

　　⑤封闭不充分

　　答：延长封闭时间，更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等）

　　⑥抗体与其它蛋白质交叉反应

　　答：更换不同的封闭液；勿在含生物素体系中使用脱脂奶粉封闭；降低二抗浓度；检测二抗与膜的交叉反应性

　　⑦洗膜不充分

　　答：增加洗涤次数

　　⑧膜干燥

　　答：保证充分的反应液，避免出现干膜现象

　　2.弱信号或无信号

　　①抗体问题

　　答：增加抗体浓度；抗体与抗原结合差；抗体丧失活性

　　②抗原不足

　　答：增加上样量

　　③抗原被封闭液遮蔽

　　答：试用不同的封闭液 ；优化封闭液中蛋白质浓度 ；缩短封闭时间

　　④蛋白质样品在储存过程中降解

　　答：重新制备样品

　　⑤转膜不充分,或洗膜过度

　　答：使用丽春红检测转膜效果，PVDF 膜需浸透,需正确的转膜操作，勿过度洗膜

　　⑥过度封闭

　　答：使用含 0.5% 脱脂奶或无脱脂奶的抗体稀释液,或更换封闭剂，减少封闭时间

　　⑦一抗失效

　　答：使用有效期内抗体,分装保存,避免反复冻融取用, 工作液现配现用

　　⑧酶和底物失效

　　答： 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物,使用新鲜的底物

　　3.非特异性条带

　　①一抗浓度过高

　　答：在满足一定的敏感性的情况下，降低一抗浓度

　　②二抗引起的非特异条带

　　答：免疫球蛋白是一个超家族，而标本中含有大量的类似球蛋白的抗原，容易和二抗引起反应，尤其是在变性的情况下，在满足敏感性要求的前提下，荧光标记一抗，酶标兔抗荧光就可以解决这个问题

　　③蛋白的降解

　　答：这个和之前一样，重新制备样品

　　④上样量过高

　　答：适当减少上样量

　　⑤洗涤不完全

　　答;可适当延长洗涤时间

　　⑥封闭不好

　　答：延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液

　　4.弥散型条带

　　①抗体浓度太高

　　答：降低抗体浓度

　　②蛋白质上样量太多

　　答：降低蛋白质上样量

　　③迁移过快、电泳温度过高

　　答：降低电泳速度，低温电泳（冷室）