复 苏

　　细胞复苏的原则：快速融化

　　必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

　　实验前准备

　　1.将水浴锅提前预热至37℃。

　　2.细胞实验室进行常规消毒，用75％酒精擦拭紫外线照射40min的超净工作台台面，保证无菌。

　　3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等即将使用的耗材及试剂。

　　取出冻存管

　　1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的对应编号。

　　2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

　　迅速解冻

　　1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断地摇动，使管中的液体迅速融化。

　　2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

　　平衡离心

　　用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3分钟。

　　制备细胞悬液

　　1.吸弃上清液。

　　2.向离心管内加入适量完全培养液，吹打制成细胞悬液。

　　3.用培养液悬液混悬沉淀细胞，细胞计数调整细胞浓度，放入培养箱中培养。

　　细胞计数

　　细胞浓度以5×105/mL为宜。

　　培养细胞

　　将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃，5％CO2的培养箱内2-4h（或者24-48h）后换液继续培养培养，换液的时间根据细胞情况而定。

　　记录复苏日期

　　结果分析

　　判断细胞复苏成功与否，需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率（细胞存活率将冻存管内剩余的细胞，台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率。呈蓝色的细胞为死细胞，活细胞不着色。用细胞计数板和计数器计数细胞，得出细胞存活率）。

　　如果复苏后95%以上的细胞贴壁，而且细胞的活性好，这就说明细胞复苏的过程没有问题。复苏的细胞恢复到正常生长，达到正常的生长特性（比如细胞群体倍增时间等）后要再冻存以补充细胞储存数量。

　　初学者易犯错误

　　● 水浴锅未提前预热或者未预热到37℃直接融化。

　　● 水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。

　　● 离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。

　　● 一次复苏细胞种类过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。

　　传 代

　　1.传代密度过高

　　一旦细胞养太久至融合度过高（>90%）才传代，容易使细胞产生老化现象，甚至是堆叠，再消化细胞时不易吹打成单颗细胞，即便再重新铺盘传代，细胞也无法回到原本的特性了。（如：单层细胞，没长满就发生堆叠现象）

　　解决方案

　　尽量避免融合度过高，镜下观察融合度约达到80%即可传代分盘。

　　细胞融合度：在细胞培养中指的是细胞在培养表面（培养皿/瓶）所占的比例。

　　2.传代密度过低

　　哺乳动物贴壁培养细胞，若细胞培养到80-90%密度需要开始传代，在传代接种细胞密度过低，细胞间距离太远，就无法在细胞间产生黏附及通信作用，帮助信号传导并活化细胞；总体细胞量不足，分泌的生长因子浓度会不足以产生利于生长的微环境，以上皆会造成增殖速度迟缓或细胞死亡。

　　解决方案

　　细胞传代时，要进行准确的细胞计数，确保铺盘的密度。

　　冻 存

　　细胞冻存的基本原理：慢冻

　　手动降温：将细胞依序放在4℃（30分钟）、-20℃（1小时）、-80℃（过夜）后移至液氮中保存。

　　程序降温盒：是一般最广泛使用的降温法，为一种特制冷冻容器（填充异丙醇或依靠特制金属导热），使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃（过夜），然后移至液氮中保存。

　　由此可以看出，程序降温精准度更高，优于手动降温。

　　细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。

　　细胞代谢过程需要各种蛋白酶的参与，而这些蛋白酶在环境温度低于-70℃时会集体罢工，低温贮藏的目的是通过超低温使代谢活动近乎停止。细胞因此进入休眠状态，使细胞“不会老”，可以长期保存。

　　因为冻融过程对所有细胞和组织都是有一定伤害的，因此，需要开发出有效的技术来防止细胞死亡和损伤。

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