传代培养是细胞培养常规保种方法之一，也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释，分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。本实验以传代大鼠骨髓充间质干细胞为例进行细胞传代的步骤做一介绍。

　　一、传代前准备

　　实验开始前，将无菌培养瓶、15ml 离心管、移液管、枪头等放入无菌超净工作台，紫外线照射 30min，以进行工作台的消毒。

　　倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。

　　二、胰蛋白酶/EDTA 消化

　　从培养箱中取出待传代的细胞，75%酒精进行瓶口消毒，吸掉培养细胞的旧培养基。PBS缓冲液洗去残留的旧培养基,重复洗两次。

　　弃去 PBS,按每 25 平方厘米 1ml 消化液比例加入消化液，消化液中 EDTA 浓度视不同细胞而定，骨髓干细胞贴壁特性强，比较难于消化，

　　可提高 EDTA 浓度的方法，本实验采用0.25%胰蛋白酶加 0.1%EDTA 的消化液证明可以很好地消化，并不会损伤细胞。放入显微镜

　　下观察，待所有细胞变圆后立即拿入超净台内，加入 6ml 细胞完全培养基终止消化。消化时间为 1-5 分钟，具体依细胞而异。

　　采用无菌吸管轻轻吹打细胞表面，注意吹打全部培养表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有细胞悬液放入一干净的 15ml 离心管内。每分钟 800 转，室温离心 5min。

　　三、细胞传代的步骤

制备细胞悬液及培养

　　吸弃上清液，不要吸到底部的细胞沉淀。向离心管内的细胞沉淀加入适量完全培养基。吹打混匀，吹打过程中尽量不要产生气泡。

　　显微镜下观察细胞分散情况，避免出现细胞成团情况，确定为单细胞悬液方可进行下一步操作。本实验以 1:2 的比例进行分瓶，通常骨髓充间质干细胞一般以 1：3 传代，传到第 3 代时，骨髓干细胞的纯度可达 95%以上。将培养瓶放入 37℃，5％CO2 的培养箱内继续培养。

　　四、结果观察

　　第二天可观察细胞贴壁生长情况，细胞培养换液时间一般为 2～3d，根据细胞生长的状态和实验要求来确定。待细胞铺满器皿底面，即可使用，也可继续传代扩大培养或换成维持液。

　　悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉，只留下少量，然后加入新鲜培养液即可。

　　当细胞悬液中碎片或颗粒物较多，感觉到比较脏时，可以将悬液移到离心管内，1000～1500rpm离心 3 分钟，弃上清，加入约 2ml 培养液，吹打至均匀，滴加 2-3 滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中。然后置于二氧化碳培养箱中培养。

　　五、传代细胞培养的实验步骤及注意事项

　　1、严格无菌：

　　传代培养时要注意严格的无菌操作，并防止细胞之间的交叉污染。

　　2、适度消化：

　　消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，酶解消化过程中要不断观察，消化过度会对细胞造成损害，消化不够则难于将细胞解离下来。对于贴壁能力较弱，容易脱壁的细胞，可以不经蛋白酶原消化处理和终止消化这两步，直接对原代培养物或经漂洗后用吸管进行吹打使细胞脱离瓶皿底壁。这种直接吹大的方法对生命力旺盛的细胞如某些肿瘤细胞较为合适。高强度机械吹打易对细胞造成伤害较大，细胞也常有较大数量的丢失，因而绝大部分贴壁生长的细胞需消化后才能吹打，一般不单独采用高强度机械吹打。

　　3、把握好消化液的最佳浓度：

　　消化液的消化能力是和溶液的 pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有 Ca2+, Mg2+和血清等因素有关，实验采用 0.25%胰蛋白酶+0.1%EDTA 的消化液证明可以很好地消化骨髓干细胞。

　　4、吹打细胞动作要轻柔：

　　吹打时用力过猛会损伤细胞。可选择用用大口径的吸管或者管口较大的一次性耗材，减少对细胞的损伤。对贴壁细胞消化后的吹打过程要有序进行，要从一边开始到另一边结束，尤其是器皿的四角处，确保瓶皿底壁各处的细胞都被吹打脱离。

　　5、传代次数不宜过多：

　　传代数是指对培养物传代的次数，它不等于细胞分裂的次数或细胞的代数，而仅代表传代操作的次数。传代对细胞的影响或伤害程度仅次于将活细胞从生物体内取出并进行原代培养的程度。只是因为传代后的细胞生长并不像刚开始原代培养时那样缓慢。每经过一次传代，细胞的生长环境就相应发生一次较大变化。体外生长的细胞若处于动荡的生活环境中，细胞的遗传特性往往容易发生改变。经过多次传代培养的细胞，往往容易转化为恶性细胞。因此，传代对细胞生长和性状会产生不利影响，一般情况下要尽可能减少传代次数。