一、细胞培养的基本概念

　　（1）基本概念

　　细胞培养：狭义的细胞培养主要是指分离（散）细胞培养，广义的细胞培养还包括单（个）细胞培养又称克隆（clone），是指单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。

　　原代培养：即第一次培养，指将培养物放在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。

　　传代：原代培养成功后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面因营养物不足和代谢物积累不利于生长或发生中毒。需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程称为传代或者再培养。

　　细胞系：原代培养物经首传代成功后，即成细胞系。如细胞系不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞系，它由原代培养中的许多细胞系列组成。如细胞系可连续传代，则称为连续细胞系，即已建成的细胞系。

　　细胞株：通过筛选或克隆化，且有特殊性质或特异标记的细胞。这些特性在以后的培养中必须持续存在。这些特性包括具有一定的标记染色体，对某种病毒的敏感性或抗性及具有特殊的抗原性等。

　　二、细胞的生长

　　（1）生长方式

　　贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。

　　悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。

　　（2）生长过程

　　游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10min-4h。

　　贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10min-4h贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）。

　　潜伏期：此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期般为6~24小时。

　　对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最为适合进行实验研究。

　　停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂，机制：接触抑制、密度依赖性。

　　（3）生长条件

　　细胞的营养需，细胞的生存环境，温度：37℃，O2，CO2：5%，pH：7.2-7.4，渗透压，无污染，无毒。

　　三、常用的器材与试剂

　　（1）常用仪器

　　超净工作台：为细胞操作提供无菌环境。紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒。

　　滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。

　　电热干燥箱：干热消毒（160℃，2h）。主要用干玻璃器皿消毒。

　　压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广。

　　CO2培养箱:CO2培养箱设定的条件:37℃，5%CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：

　　①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。

　　②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14h）。

　　③箱内火菌蒸馏水 3000ml 蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。

　　其它仪器：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，液氮罐，自动双重纯水蒸馏器，纯水仪等。

　　（2）常用耗材

　　耗材：培养瓶，吸管，培养板，冻存管，酒精灯

　　（3）常用试剂

　　消化液

　　胰蛋白酶：是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制，常用的胰蛋白酶液浓度是0.25%。用滤器过滤除菌，如经费充裕可以直接购买已经配制好的胰酶，无需自己配制。

　　胰蛋白酶作用机制：胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。

　　胰蛋白酶液消化时间：2-10 min。可用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。

　　培养基

　　培养基（培养液）：是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。

　　天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好。缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染。

　　合成培养基：合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。主要成分：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。缺点：缺少某些成分，不能全满足体外细胞生长需要，只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。

　　血清培养基

　　血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分。

　　常用血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量为好。

　　血清质量好坏是实验成败的关键，优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30min。血清的消毒：过滤除菌。

　　抗菌素的使用

　　抗生素的作用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素最终使用浓度为每毫升100单位，方便、广谱、稳定。

　　完培的组成

　　基础培养基80%一95%，血清5%-20%，碳酸氢钠2.0g/L，青、链霉素各100单位/毫升。

　　四、细胞的传代方式

　　（1）悬浮细胞

　　直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l/2-2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。

　　离心法传代：离心（1000 r/min）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。

　　（2）半悬浮细胞

　　此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。

　　（3）贴壁细胞

　　采用酶消化法传代，常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。

　　详细步骤:

　　1、吸光培养瓶中的培养基，加入1-2ml PBS清洗2-3遍，吸出PBS。

　　2、加入1-2ml 0.25%的胰蛋白酶液，以消化液能覆盖整个瓶底为准。

　　3、静置2-10min（具体时间根据细胞状态确定），显微镜下动态监测，当细胞消化全，立即加入含血清培养基，终止消化。

　　4、转移至离心管，离心（800r/min，5min）。

　　5、吸去胰蛋白酶液，加入培养液，反复吹打细胞沉淀，混匀，形成细胞悬液。

　　6、吸取适量细胞悬液，接种于新的培养瓶内。

　　7、加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内，然后放入培养箱中培养。

　　五、细胞的冻存与复苏

　　（1）冻存和复苏的原则

　　慢冻快融，当细胞冷到0℃以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。

　　（2）慢冻程序

　　方法一：当温度在-25℃以上时，-1~-2℃/min；当温度达-25℃以下时，-5~-10℃/min；当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中细胞冻存。

　　方法二：冷冻管置于已设定程序之程序降温机中每分钟降-1～-3℃至-80℃以下，再放入液氮长期保存。

　　方法三：购买无血清快速细胞冻存液，可以省掉程序降温的步骤，直接冻存。补充：一般冻存液的配置：90%血清+10%DMSO。

　　（3）基低温保护剂的应用

　　在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。

　　（4）细胞冻存步骤

　　1、预先配制冻存液：含20%血清培养基10%DMSO

　　2、取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×106~5×106细胞/ml）

　　3、加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。

　　4、按照慢冻程序对细胞进行冻存。

　　（5）细胞复苏步骤

　　1、从液氮中取出冷冻管，迅速投入37℃水浴锅，使其融化（1分钟左右）。

　　2、立即转移至离心管，加入适量培养液。

　　3、以800r/min离心5分钟。

　　4、去上清，加新鲜培养液，吹打混匀成细胞悬液，转移至培养瓶，放入培养箱培养。

　　六、细胞计数

　　（1）人工计数法

　　吹打待测细胞悬液中细胞，使其在悬液内分布均匀，这样只需测定很小一部分体积的细胞悬液中的细胞数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

　　酒精消毒计数板：用酒精棉将细胞计数板和盖玻片全擦拭干净，并将盖玻片盖于细胞计数板上；

　　转移盖玻片：吸取10 ul单细胞悬液，并沿着盖玻片边缘滴加，使细胞悬液填满盖玻片和计数板之间区域，注意避免产生气泡，细胞悬液亦不能流入计数板的边槽中，之后静置3 min；

　　数细胞：随机选取计数板上其中4大格并记录4大格中的细胞总数，压线的细胞按照数上不数下，数左不数右的原则，之后按照以下公式进行计算：

　　细胞数／mL=4大格细胞总数／4×104×稀释倍数

　　七、注意事项

　　（1）注意事项

　　计数前：计数前，注意吸尽培养皿里的细胞，充分混匀，使细胞分散成单个细胞。

　　实验操作台：实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。

　　吸管：吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。

　　手：不能用手触及已消毒器皿瓶口、瓶塞内部，吸管前部等所有可能与细胞接触的部分，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。

　　火焰灭菌时间：开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。

　　换液：换液时倾倒废液，瓶口不能接触废液缸，速度不能过快，防止废液四溅。

　　吹打细胞：吹打细胞时，要注意边角的细胞是否吹打下来。

　　相对较脏的物品:手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上，即不可以在开放容器上方操作。

　　交叉污染:每次操作只处理一株细胞，以免造成细胞交叉污染。

　　自身的安全:注意自身的安全，对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心。操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心有毒性试剂例如DMSO，并避免尖锐物品伤人等。

　　冻存:从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液。将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤。冻存和复苏最好用新配制的培养液。