实验原理

　　将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理，分散成单细胞，置于合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

　　原代细胞保留了很多来源组织的重要生理特性，能高度模仿体内的情况，且没有遗传和化学的改变。因此，原代细胞成为许多研究中理想的细胞模型。

　　应用简介

　　凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。通过原代分离获得的细胞具有与体内细胞相似的生物学特征，是研究生物体相关生命活动的理想材料。

　　实验方法

　　（一）悬浮细胞的分离方法

　　组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，可采用低速离心。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。

　　（二）实体组织材料的分离方法

　　对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。其中，机械分散法的特点是简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差，适用于处理纤维成分少的软组织。消化分离法是指把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。

　　（三）小鼠肝细胞原代培养

　　1、取肝脏：将小鼠断颈致死，取肝脏；

　　2、除杂物：剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物；

　　3、研磨肝脏：用手术剪将脏器剪成小块并研磨；

　　4、胰酶消化：加入胰酶消化，使细胞分离；

　　5、滤网去杂：用滤网过滤，除去大组织块；

　　6、细胞计数：血球计数板计数。

　　常见问题

　　（1）原代培养材料的选择，尽量选取繁殖能力较强的组织，如胚胎、幼小的生物体或者肿瘤组织等。

　　（2）要注意无菌操作。其操作要求应高于外科手术、

　　（3）整个取材操作要迅速，时间不能过长，以确保胚胎细胞活性。

　　（4）运用消化法时胰酶温度应低于37℃，浓度只需平时消化细胞浓度的一半。因为此过程不像消化培养细胞时的1~10min，而是至少20min，先消化下来的细胞在此胰酶消化液中继续消化了10min以上。所以胰酶不能作用过强，否则这些细胞易被损伤而不易生存。

　　（5）如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能黏附于瓶壁时再使之与培养液接触，匆使组织块漂浮起来。如果组织块没有黏壁，则细胞不易生长，即使生长也因没有贴在瓶壁上，从而因不能观察到而无法收集到生长的细胞。

　　（6）原代培养操作时，也可以使用未添加血清的DMEM或PBS洗涤子宫、胚胎或组织块等。