核酸降解本质

　　核酸降解是DNA/RNA分子中的碱基和戊糖间的氮糖苷键，或磷酸二酯键在物理因素、化学因素和生物因素等作用下发生水解，使DNA/RNA链发生断裂。

　　核苷磷酸化酶：能分解核苷生成含氨碱基和戊糖的磷酸酯酶。广泛存在于生物体内,催化的反应可逆。可在核苷水解酶作用下继续分解核苷成嘌呤碱、嘧啶碱和戊糖。

　　核苷水解酶：主要存在于植物和微生物体内，只水解核糖核苷。

　　核酸降解原因

　　DNA降解的因素很多，主要分为物理因素，化学因素和生物因素。

　　一、物理因素：温度，机械剪切力、核酸的反复冻融、高温煮沸及辐射等。

　　二、化学因素：PH值，水解反应，氧化反应等。

　　三、生物因素：酶解及微生物侵染等作用。

　　01物理因素的影响

　　★ 温度：高温条件下，RNA不稳定，易加速磷酸二酯键的水解，使核酸降解；

　　★ 机械剪切力：包括剧烈震荡、搅拌、细胞突然至于低渗溶液中，以及让溶液快速通过狭长的孔道；

　　★ 核酸的反复冻融、高温煮沸及辐射等，均会导致核酸的降解。

　　02化学因素影响水解

　　★ PH值：氢离子参与催化磷酸二酯键、糖苷键的水解，但糖苷键比磷酸二酯键更易被酸水解。过高或过低的PH值都易破坏复键。核酸(特别是RNA)在碱性溶液中十分容易降解；

　　★ 氧化反应：会氧化碱基中的含氨杂环，使其变性，从而改变一级与二级的核酸构象；

　　★ 苯酚在空气中被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于DNA的分离，会使磷酸酯键断裂，造成DNA的降解。

　　03生物因素影响

　　★ 酶解：核酸酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构，使其降解。

　　1.核酸酶(磷酸二酯酶)

　　核酸内切酶：在环境或生物体内具有识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶统称为限制性核酸内切酶。作用方式从多聚核苷酸链中间开始，在某一个位点切断磷酸二酯键。如DNase，RNase等。

　　核酸外切酶：核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端(3'-端或5'-端)开始，逐个水解切除核苷酸。如蛇毒磷酸二酯酶，牛脾磷酸二酯酶等。

　　2.核苷酸酶(磷酸单酯酶)

　　专一性的磷酸单酯酶：3'-核苷酸酶，5'-核苷酸酶

　　非专一性磷酸单酯酶。

　　★ 微生物侵染：微生物会将DNA作为营养物质或是其分泌的化学物质含酶。

　　预防降解的方法

　　预防RNA降解的方法:

　　★ 去除环境中RNase酶的污染或强有力地抑制其活性。

　　★ 获取样品后最好立即提取RNA，若无条件立即实验，应于-80℃液氮中保存样品，提取时取出样品后立即在低温下研磨裂解细胞，以防RNA降解。

　　★ 在总RNA提取分离的最初阶段，联合使用Rnase的特异抑制剂，尽可能的灭活胞内的Rnase的活性。

　　★ 避免样品的反复冻融。

　　★ 保证裂解液的质量，裂解液的用量不足，也会导致RNA降解。

　　★ RNA提取后，放入-80℃保存，防止降解。

　　预防DNA降解的方法:

　　★ 简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；

　　★ 减少化学物质对DNA的降解，为避免过酸、过碱对DNA双链中磷酸二酯键的破坏；

　　★ 防止基因组DNA的生物降解，主要是DNase降解基因组DNA，Dnase需要二价金属阳离子Mg2+等的激活，可用EDTA等金属离子整合剂整合Mg2+以抑制Dnase的活性；

　　★ 减少物理因素对DNA的降解，物理降解因素主要包括机械剪切力(如剧烈震荡、搅拌等)；

　　★ 避免样品的反复冻融，可将DNA分装保存于缓存液中；

　　★ 所有试剂应用无菌水配制，耗材经高温灭菌；

　　★ 避免DNA的过高温处理等。