一、细菌离心后，加入溶液蜗旋振荡时，发现菌体呈絮状不易混匀，或成细砂样。————很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间、降低培养温度试试看，通常降低培养温度 会使细菌生长更加稳定；同时也可以试试平板培养，培养后，用PBS将菌落洗下，再进行质粒的提取，固体培养基上细菌生长的要好一些。

　　二、加入溶液Ⅱ，菌液浑浊度没有发生明显变化。————裂解不完全，主要问题是发生在溶液Ⅱ上。确保10%SDS是澄清的，确认NaOH是有效的，如使用的是试剂盒，确认溶液I是澄清没有沉淀的。如确认原因不是发生在溶液II上，而是细菌浓度比较高，可相应增加溶液I/III的体积。此外，还有可能是"杂菌"污染。

　　三、加入酚仿抽提，离心后在水相和有机相间没有变性蛋白层，但随后的乙醇沉淀发现大量的半透明沉淀，溶解后蛋白浓度高。————乙醇沉淀时，较纯的质粒沉淀应该是白色（PEG纯化的沉淀是透明的，肉眼不易发现），如沉淀是半透明的凝胶状，则是蛋白含量高。出现此类问题时确认两点∶

　　1.平衡酚是否被氧化、pH是否是8.0。

　　2.溶液III/Ⅲ反应后，离心的上清pH是否在8.0左右。有时，由于溶液Ⅲ配置的问题，导致溶液I/IIL反应后离心的上清pH与8.0偏差较大，导致平衡酚抽提时没有有效的将蛋白抽提出来，有时，离谱的pH会导致水相和平衡酚互溶。

　　四、使用酚仿抽提方法，质粒A260/A280的纯度也很好，但酶切不能完全切开。

　　1.确认酶的有效性；

　　2.平衡酚是否被氧化而呈现棕色，而非正常的黄色；

　　3.是否不小心吸入了痕量的酚；

　　4.乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分，残留的盐类会影响酶切；

　　5.乙醇漂洗后是否完全干燥，残留的乙醇会影响酶切；

　　五、 提取质粒中RNA没有去除。

　　————主要原因是RNase失效，或效率不高。

　　建议∶1.更换RNase A，并保证其储存条件是正确的；

　　2. 对于手工提取质粒，可单独增加一步去处RNA的步骤，即溶液Ⅲ反应后，离心的上清中加RNase，室温37度去RNA10min~30min，但需要保证你的RNase A是经过失活DNase的，同时较高温度（如50度）会更加快速完全的去除RNA，但本人经验，经过高温处理的质粒质量也不高。

　　六、传统手工大提质粒，使用PEG8000纯化的问题。

　　————A.PEG8000不需要灭菌，当然，你要确认你的PEG8000是分子生物学使用级别（我们一直使用的SIGMA的）；

　　如果PEG8000纯化后的得率很低，需要确认一下∶加入PEG8000前，质粒溶液是否是TE，而不是含有大量其它杂盐得溶液。在PEG8000纯化前，质粒溶液应该是经过乙醇或异丙醇沉淀，且经过70%乙醇漂洗过的；沉淀步骤应在冰上或4度进行。

　　C. 关于PEG8000处理后离心看不见沉淀的问题∶PEG8000的沉淀是透明的，有时可以看到沉淀，而有时很难辨出沉淀

　　六、 试剂盒提取质粒，质粒浓度不理想的问题。

　　———检查漂洗液，是否配置太久，而且在使用后没有旋紧盖子。

　　七、 .培养基、抗生素、质粒提取都没有问题，而细菌菌液提取不到质粒。————可以使用细菌质粒提取试剂盒。

　　八、 原先测序鉴定没有问题的细菌，37度摇菌后发现质粒大小或序列出现异常。————这种情况出现的几率较小。常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。

　　解决办法∶a.降低培养温度，在20~25度下培养，或室温培养可明显减少发生概率；

　　b.使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。