一、编号：YQ0605

　　二、标题：流式细胞术检测细胞周期和凋亡操作规程

　　三、关键词：流式细胞术 细胞周期 细胞凋亡 操作规程

　　四、目的：规范流式细胞术检测细胞周期和凋亡操作

　　五、背景知识：流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等多门学科的技术，可以测定细胞的容积、大小、形状，细胞内生物大分子如DNA、RNA、蛋白质、酶、多糖等物质的含量，细胞膜上的抗原和抗体，活细胞膜的流动性，应用非常广泛，细胞周期分析和细胞凋亡检测即其中之一。

　　六、原理：其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：

　　1.细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。

　　2.光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。

　　七、仪器设备和材料：待测细胞悬液(106/ml)，PBS溶液，70乙醇，300目尼龙网，PI染液（将PI溶于PBS中，终浓度为100μg/ml，用棕色瓶4℃避光保存），流式细胞仪（FACSCalibur，BD公司）。

　　八、操作步骤

　　1、收集细胞，数目约（1～5）×106/mL，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。

　　2、3ml PBS洗涤1次。

　　3、离心去PBS，加入预冷的70%的乙醇固定，4℃，4～8小时。

　　4、离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。

　　5、300目的尼龙网过滤1次，500—1000r/min离心5min，弃去PBS。

　　6、加1ml PI染液4℃避光染色30min。

　　7、流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激发光波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图，并用ModFit软件模型分析细胞周期与凋亡细胞比例。

　　8、结果判断：在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正常细胞相比，前散射光降低，而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关；在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0，则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45，可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准，两者分别为0.35和0.7，可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。

　　九、注意事项

　　细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致，在分析结果时应该注意。