假阴性

　　1.酶失活

　　需要更新酶，或者新旧两种酶同时使用，分析是否因酶的活性丧失或不够二导致的假阴性。需注意，有可能是忘记加Taq酶或溴乙锭。

　　2.引物

　　引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增的条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增。

　　3.Mg2+浓度

　　Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

　　4.反应体积的改变

　　通常进行PCR扩增采用的体积为20μL、30μL、50μL或100μL，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20μL后，再做大体积时，一定要摸索条件，否则容易失败。

　　5.物理原因

　　变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

　　6.靶序列变异

　　靶序列发生突变或缺失，则会影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

　　假阳性

　　1.引物设计不合适

　　选择的扩增序列与非目的扩增序列的同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性，需要重新设计引物。

　　2.靶序列或扩增产物的交叉污染

　　整个基因组或大片段的交叉污染导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不耐高温的物质外，所有试剂或器材均需高压消毒；所用离心管及加样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

　　空气中的小片段核酸污染。这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性，可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

　　3.出现非特异性扩增带

　　PCR扩增后出现的条带与预计的大笑傲不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

　　非特异性条带的出现原因有：①引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。②Mg2+离子浓度过高、退火温度过低及与PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异性条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法。

　　4.出现片状拖带或涂抹带

　　PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带，原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。