细胞冻存和复苏操作步骤

2023-02-13 10:29:01

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　　原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。原代培养细胞常有不同的细胞成分，生长缓慢，但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征。利用原代细胞培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。其操作步骤如下。

　　1、冻存细胞：

　　（1）选对数增生期细胞(证明无支原体污染)，在冻存前1d换液。

　　（2）按常规方法把培养细胞制备成悬液，计数，使细胞密度达5×10^7／ml左右密度，离心，去上清。

　　（3）加入配制好的冻存液（培养液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂10％二甲基亚砜(DMSO) 或甘油，可使冰点降低，使细胞内水分在冻结前透出细胞外。

　　（4）分装于无菌冻存管中，每管加1.5m悬液。

　　（5）旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标记。

　　（6）冻存：在特殊的仪器或简易的液氮容器中，按-1℃／min的速度，在30～40min时间内，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。

　　操作时应戴防护眼镜和手套，以免液氮冻伤。

　　2、复苏细胞：

　　（1）从罐中取出冻存管。

　　（2）迅速放入36℃～37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s内完成。

　　（3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。

　　（4）低速离心(500～1000r／min) 5min，去上清后再用培养液洗一次。

　　（5）用培养液适当稀释后，装入培养瓶37℃培养，次日更换一次培养液后，继续培养。以后仍按常规进行培养。

　　冻存细胞数量要充分，密度应达到107／ml，在融后稀释20倍时，仍能保持5×105／ml数量。

　　细胞的冻存和复苏，让某些细胞可以保存到现在。