1949 年至 1960 年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”，这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油作为保护剂。Lovelock（1959）等人发现了一种新的化学保护剂，这就是人们熟悉的二甲基亚砜（DMSO）。而且，用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。目前，无论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品和设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟和完备。

　　冷冻与复苏原理

　　在低于-700C 的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低， 细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。

　　这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。

　　如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。

　　当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。

　　在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2 分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。

　　冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。而且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。

　　1.冷冻速率

　　冷冻速率是指降温的速度，直接关系到冷冻效果。细胞在冷冻过程中会发生如下变化：当细胞被冷至-50C 时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰；当被冷至-5～-150C 之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能。其结果是，细胞内水分子为了和细胞外水分子保持化学能的平衡，会向细胞外流动。

　　2.冷冻保存温度

　　冷冻保存温度是指能长期保存细胞的超低温度，在此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和功能。不同的细胞和生物体以及使用不同的冷冻保存方法要取得同样的冷冻保存效果，冷冻保存温度可以不同。但从实际和效益的观点出发，液氮温度（-1960C）是目前最佳的冷冻保存温度。在-1960C 时，细胞的生命活动几乎完全停止，但复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻过程得当，一般生物样品在-1960C下均可保存十年以上。应用-700C～-800C保存细胞，短期内对细胞的活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。在冰点到-400C范围内保存细胞的效果不佳。

　　3.复苏速率

　　冷冻保护体外培养物，除了必须有最佳的冷冻速率、合适的冷冻保护剂和冻存温度外，在复苏时也必须有最佳的复温速率，这样才能保证最后获得最佳冷冻保存效果。复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。复温速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说，复温速度越快越好。常规的做法是，在 370C 水浴中，于1-2分钟内完成复苏。复温速度过慢，细胞内往往重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。

　　冷冻保存方法

　　按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-700C～-800C，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至-1000C 以下，再直接投入液氮保存的方法。以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。以该中方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。但目前细胞冻存最常用的仍是前一种方法。

　　1.非玻璃化冻存方法

　　下面以肿瘤细胞和杂交瘤细胞为例：

　　在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO 对人体有毒，故在配制时最好带手套。在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧、以免液氮从液氮罐内溅出。若液氮溅出，可能对皮肤造成冻伤。操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。

　　应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。另外，在每批细胞冻存一段时间后，要复苏1~2 管，以观察其活力以及是否受到微生物的污染。冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时，需要从-1960C的液氮中取出冻存管，立即投入37~400C温水中，温差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。

　　2.玻璃化冻存方法

　　以下以人单核细胞为例：

　　玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果，不需要复杂的仪器设备，具有液氮储存设备即可使用。目前，该方法已在胚胎冷冻方面得到广泛应用，但很少应用于一般细胞的冻存。这可能与需要配制较复杂的冻存液以及冷冻前和复苏后较烦琐的操作有关。因为玻璃化冷冻保护液中的冷冻保护剂的浓度较高，室温下对细胞具有毒性（但在 40C时毒性大为减弱）。

　　所以，冷冻保护液的滴加全过程必须在 40C 冰浴中进行。另外，滴加速度要缓慢，如果滴加速度过快，则在细胞外产生很高的渗透压，造成细胞膜的损伤，导致细胞死亡，故要缓慢滴加，让冷冻保护剂有足够的时间缓慢渗透到细胞内，达到细胞内外的平衡。

　　冻存细胞的复苏方法及注意事项

　　1.非玻璃化冻存复苏方法

　　主要材料：

　　(1) 仪器设备：恒温水浴箱、高速离心机。

　　(2) 培养用液：完全培养液。

　　复苏过程：

　　(1) 调配370C~ 400C的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至370C~400C。

　　(2) 从液氮中取出冻存管，立即投入370C~400C温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解。

　　(3) 将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培养液，轻轻吹打混匀。

　　(4) 将细胞悬液经800~ 1000r/min离心5min，弃上清夜。

　　(5) 向细胞沉淀内加入完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。

　　结果：复苏后的细胞应该保持其冻存时的活力，活细胞数达 90%以上。

　　注意事项：细胞冻存悬液一旦融解后，要尽快离心除去冷冻保护液，防止冷冻保护剂对细胞产生毒性。实验人员在复苏细胞过程中，同样应具有自我保护意识，避免被液氮冻伤。

　　2.玻璃化冻存复苏方法

　　主要材料：

　　(1) 设备：高速离心机。

　　(2) 培养用液：添加20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液、培养液。

　　操作过程：

　　(1) 将冻存管从液氮中取出，立即投入冰浴中5min。复温速率约5600C/min。一次可以进行多个冻存管的复苏。

　　(2) 将冻存管两端剪断，可以将5ml细胞冻存悬液转移到50ml离心管中。

　　(3) 沿离心管壁缓慢加入已在冰浴中预冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液。前10min以0. 2m1/min的速度加入，后10min以0. 5ml/min的速度加入，接着的15min以0.75ml/min的速度加入，最后30min以1ml/min的速度加入。全过程约为65min，都在冰浴中进行。

　　(4) 将稀释后的细胞悬液以400r/min离心5min，去除上清。向细胞沉淀中加入培养液重新悬浮细胞，用于培养。

　　结果：复苏后的细胞应该保存其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。

　　注意事项：复苏时，冷冻保护液的稀释及去除过程与冻存前冷冻保护液的滴加过程一样，不能在室温下而必须在40C冰浴中进行，避免在室温下冷冻保护剂对细胞产生毒性。稀释过程也要缓慢进行，保证有足够的时间让冷冻保护剂从细胞内渗出，以达到细胞内外的平衡，避免高渗透压的损伤。