材料与方法

　　试剂：①化学试剂：碳酸氢钠、磷酸氢二钠、硫酸镁、考马斯亮兰。②细胞培养试剂与培养板：F12培养液、胎牛血清、胰蛋白酶(宝泰克)、胶原酶Ⅰ、Ⅱ型、L-谷氨酰胺、二巯基乙醇、青霉素、链霉素、6孔、24孔、96孔培养板。

　　仪器：凝胶成像仪、数码照相系统、二氧化碳培养箱、酶标仪、PCR扩增仪、超声波清洗器、倒置显微镜、恒温震荡培养箱、CLP-800电泳仪、超高速冷冻离心机、梅特勒-托利多AB204-N单量程万分之一电子天平、超小型电泳仪Mupid-2。

　　实验材料：新西兰大白兔。

　　动物模型及分组：雄性新西兰白兔8只，3～5个月龄，体重2.5～3.5kg，平均2.85kg。随机分两组，每组4只。

　　手术方法：①实验组：用20%乌拉坦(5ml/kg)静脉麻醉，取髌内侧切口长约2cm，逐层切开软组织，打开关节腔，将髌骨外翻，将双膝关节内侧副韧带、前后交叉韧带切断并切除内侧半月板，注意勿损伤关节软骨；冲洗关节腔后，逐层缝合切口，术后应用肌注青霉素40万U/日，持续7天，术后不固定伤肢，每天驱赶兔奔跑2次，每次强迫其活动1小时，模型建立需8周。②对照组：实验动物采用同样的麻醉方法，只打开关节腔后，同样将髌骨脱位，保持关节腔暴露时间大致同实验组，其余处理同上。

　　取材鉴定：手术后 8 周空气栓塞处死动物，无菌条件下取双侧膝关节标本。实验组软骨面色泽灰暗，表面粗糙糜烂，软骨下骨外露，骨赘增生明显，尤以胫骨内侧髁明显。对照组软骨表面光滑，色泽正常，未见软骨表面裂纹及凹陷，无骨赘形成。

　　主要实验试剂及药物制备：①D-Hank's平衡盐溶液：电子天平分别称量NaCl 8.00g/L、KCl 0.40g/L、NaHPO4・H2O 0.06g/L、KH2PO4 0.06g/L、NaHCO3 0.35g/L、酚红0.02g/L，加入去离子水溶解，搅拌均匀，加入青霉素20万U/ml 500μl、链霉素20万U/ml 500μl，定容至1000ml，浓盐酸调节pH值至7.0，过滤**备用。②F12细胞培养液：电子天平分别称量NaHCO3 2g、MgSO4 74.64mg/L、葡萄糖2g，加入F12干粉中，用去离子水溶解，加入青霉素20万U/ml 500μl、链霉素20万U/ml 500μl，搅拌均匀，定容至1000ml，浓盐酸调节pH值至7.6，过滤**并以500ml/瓶分装，按比例加入胎牛血清、2-ME及L-谷氨酰胺，4℃备用。

　　软骨细胞提取与培养：将手术收集的软骨标本放入10ml无菌玻璃平皿，倒入D-Hank's液掩盖标本；在另一平皿中，加入少量F12培养液，用手术刀切碎软骨，使成1～2mm3的小块；移入离心筒中，用F12培养液掩盖，离心1000rpm 5分钟；收集全部切碎软骨，除去F12，加入8ml 1×透明质酸酶，室温下作用5分钟；除去透明质酸酶，另加入16ml透明质酸酶，室温下作用10分钟；祛除透明质酸酶，用F12清洗两遍，每次10ml，离心1000rpm 5分钟。用1×胶原酶4ml清洗5分钟，祛除清洗液；加入8ml胶原酶，37℃培养30分钟，离心600rpm 5分钟；保留上清至无菌离心筒中；加入20ml胶原酶，37℃培养90分钟继续消化；视组织消化程度，一般消化至组织蓬松，呈絮状；收集上清液，1000rpm离心8分钟，获得细胞团；弃上清，将细胞悬浮于16mlF12培养液中，200目过滤至新无菌离心筒中。10μl移液器取细胞悬液1μl，计数。按5×104接种于培养瓶中。37℃、5%CO2孵箱中培养。2～4日，F12培养液换液1次。

　　软骨细胞生长曲线的测定：取生长状态良好的细胞，制成细胞悬液。经计数后，将细胞以1×10^4/ml接种于24孔板中；每隔1天取3个孔细胞进行计数，计算均值，培养2～4天给未计数的细胞换液；以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，将计数点连接成曲线。

　　结果与分析

　　骨性关节炎软骨组织病理：显微镜下观察，实验组软骨表面出现溃疡，各层结构界限消失，潮线紊乱乃至多重，软骨细胞减少，但大量簇集。对照组软骨表面光滑，层次清楚，软骨细胞排列整齐，分布均匀，潮线清晰完整，软骨细胞数量正常，无簇集。

　　软骨细胞：骨性关节炎软骨细胞与正常软骨细胞形态相似，为贴壁细胞，呈多角形，偶可见梭形，原代细胞培养时软骨细胞呈岛状生长；传代软骨细胞贴壁良好，细胞饱满、透明，细胞多层生长时，可见细胞分泌胞外基质。

　　正常、骨关节炎软骨细胞生长曲线：传代正常、骨性关节炎软骨细胞近似“S”形，生长周期约在3周，经过1周的潜伏期，软骨细胞进入对数生长期，2周左右达到平台期后稳定生长，本实验选用作图法，即在细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增加一倍所需时间。据观察，骨性关节炎软骨细胞生长周期较正常软骨细胞生长周期短，且于传代培养1～1.5周两种软骨细胞均处于对数生长期，适于进一步进行实验研究。