贴壁细胞的培养

　　（1）贴壁细胞的复苏

　　在准备进行细胞复苏实验时，应提做好一下两点准备：1.提把超净工作台紫外灭菌30分钟；2.提把水浴锅打开，使水温保持在37摄氏度，并预热复苏细胞所用的培养基。上述准备工作完成以后就可以从液氮中取出保存的细胞，本着“慢冻速融”的原则，把细胞放进水温37摄氏度的水浴锅中并不断搅拌，使冷冻的细胞迅速融化，，大限度的保存细胞的活力，这个过程，好在两分钟之内完成。细胞解冻后放在离心机中以1000 rpm的转速离心3-5分钟，离心结束小心弃去上清，并用提预热的完，全培养基把细胞吹打混匀，再转移至规格合适的培养器皿中，放入细胞培养箱培养即可。

　　（2）贴壁细胞的传代

　　当我们在准备给贴壁细胞进行传代的时候应该确认以下两点：1.先把细胞从细胞培养箱中拿出，放在显微镜下观察，确保细胞状态良好，没有污染；2.观察细胞的汇合度达到70%-90%，细胞汇合度太低或者太高时对细胞进行传代均不利于细胞生长。只有满足这两点基本条件，我们才能给细胞传代。给细胞传代时，先我们弃去培养基，用pH=7.4的无菌的磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗细胞2-3次，动作要轻柔防止细胞脱落。清洗完细胞后再加入终浓度为0.25%的胰蛋白酶消化液消化细胞，消化过程中把细胞放在显微镜下观察，直到细胞被消化成一个一个单独的小圆球时加入完，全培养基终止细胞消化，消化时间要把握好，消化时间太短细胞没有消化下来，时间太长则会影响细胞活性。消化下来的细胞吹打混匀后以1:3-5的比例分装到新的培养器皿中再加入足量的完，全培养基继续扩大培养。

　　（3）贴壁细胞的冻存

　　冻存细胞时，先我们弃去培养基，用pH=7.4的无菌的磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗细胞2-3次，动作要轻柔防止细胞脱落。清洗完细胞后再加入终浓度为0.25%的胰蛋白酶消化液消化细胞，消化过程中把细胞放在显微镜下观察，直到细胞被消化成一个一个单独的小圆球时加入完，全培养基终止细胞消化，消化下来的细胞吹打混匀后，按照以下比例混匀放入冻存管中：60%的胎牛血清（FBS）＋30％细胞悬液＋10%二甲基亚砜（DMSO）。特别值得注意的是，在冻存管上要标注清楚冻存的细胞名称，细胞冻存的时间，冻存细胞的代数等信息。本着“慢冻速融”的原则，我们把写好信息的冻存管放入慢冻盒中，放入负八十度冰箱冷藏十二个小时后再把细胞取出放入液氮中保存。

　　贴壁细胞的转染

　　在准备做细胞转染的一天我们把细胞铺进细胞培养皿中，加入完，全培养基培养24小时，使得细胞汇合度达到百分之六十到百分之八十。在转染需要把完，全培养基换成无双抗的完，全培养基，以排除双抗对转染效率的影响。根据转染的细胞数不同选取适量的纯培养基分别稀释质粒和lipo3000，其中稀释完的质粒中加入p3000充分混匀后再加入稀释过的lipo3000中，把混合液轻柔的吹打混匀，室温孵育20分钟。孵育结束后把质粒-p3000-lipo3000混合液加入细胞培养皿中，然后再轻轻摇匀，放入细胞培养箱中继续培养6个小时，再更换成带有双抗的完，全培养基即可。