进行单细胞测序，首先要进行单细胞的分离。尽管目前已有多种从异质性细胞群体中分离单细胞的方法，但分离单细胞依然是一项巨大的技术挑战。常用的单细胞分离方法主要有：连续稀释法、口吸管技术、显微操作法、荧光流式分选法、激光捕获显微切割技术以及微流控技术等。这些方法各有利弊，要根据具体情况选择合适的方法。

　　连续稀释法

　　连续稀释法是指通过对细胞进行一系列的倍比稀释，最终使细胞处于单个状态，理论上每μL约1个细胞，然后用移液器吸取相应容积的细胞悬液进行单细胞分离的一种技术方法。该技术已成功应用于不同组织的干细胞、前体细胞体外克隆形成分析的研究。

　　优点：

　　操作简便。

　　成本低，一般不需要特殊的设备。

　　缺点：

　　分离效率低，一般在20%左右。

　　需要研究人员排除大量空白孔和多细胞孔，费时费力。

　　细胞分离过程依赖梯度计算，容易出现错误。

　　口吸管技术

　　口吸管技术是指在显微镜下选择形态较好的细胞，然后用玻璃移液器分离出单细胞的一种技术方法。

　　优点：

　　操作简便。

　　成本低。

　　对细胞几乎无损伤。

　　缺点：

　　对操作人员的熟练度要求较高。

　　显微操作法

　　显微操作法是指在高倍倒置显微镜下，研究人员可以利用显微镜操作器（手动或自动）实现单细胞获取的一种技术方法。此技术主要应用于目标细胞所在群体数量较少的样品的分离。

　　优点：

　　能够准确地控制单细胞的吸取与释放。

　　可以从不同的发育阶段或多样化的群体分离单个细胞。

　　缺点：

　　通量低，需要大量的起始量。

　　细胞特异性由显微镜决定，并利用微量移液管分离，可能不够准确。

　　流式分选法

　　流式分选法是一种通过流式细胞仪，根据细胞特异性分子标志或者细胞光散射的特性，分选单个细胞或者特殊细胞群的一种现代细胞分离技术。

　　优点：

　　高通量。

　　少量细胞分选时，精度高，速度快。

　　细胞表面标志物的特异标记，能够确保特定细胞的分离。

　　荧光标记可用于分离亚群。

　　缺点：

　　无法扩展到大规模项目

　　设备昂贵。

　　激光捕获显微切割技术

　　激光捕获显微切割技术是一项在显微镜下，从冰冻/石蜡包埋组织切片（或细胞固定在装配有可以激光脉冲激活的热塑膜的涂片）中分离、纯化某一类型细胞群或单个细胞的技术。

　　优点：

　　无需解离组织，制备细胞悬液。

　　能够在显微镜下直观准确、快速地获取单个细胞或单一细胞亚群。

　　在天然环境下从完整组织中快速分离细胞，保留所分离细胞的RNA完整性。

　　缺点：

　　需要适当的组织处理，组织必须是冷冻保存或固定的。

　　显微切割可能存在挑战。

　　小的细胞可能难以分离。

　　在细胞分离和组织切割时，可能存在RNA污染。

　　微流控技术

　　在单细胞研究领域，利用微流控系统分离单细胞，代表性方法有液滴式微流控和芯片式微流控。其中芯片式微流控的相关技术已经成熟。其主要是通过微流控芯片隔离流动通道中的单个细胞从而达到细胞分离的目的。

　　优点：

　　高通量。

　　上样体积小，节约原料、试剂与样本。

　　检测结果周期短，可以实现快速测量，节约时间。

　　可根据细胞表面标志物分离特定细胞。

　　缺点：

　　单元大小必须均匀。

　　消耗品昂贵。