GST融合蛋白的表达与纯化

　　纯化实验方法

　　材料准备：菌种，雌性小鼠（6~8周龄），LB液体培养基，氨苄青霉素，细菌裂解缓冲液，吸附缓冲液，洗脱缓冲液等（材料未详细列出，可根据实验sop进行准备）

　　GST蛋白提取步骤

　　复苏菌液：在无菌条件下取10ml LB液体培养基，加入1%体积的菌液，1‰体积的氨苄青霉素（Amp），37℃培养箱振荡培养过夜；

　　诱导表达：取500ml LB液体培养基，加1%体积复苏好的菌液，1‰体积的氨苄青霉素(Amp)，扩大培养至菌液OD600约05-0.8。然后加入IPTG至终浓度为1mmol/L，进行诱导培养，5h后结束诱导（诱导剂浓度、诱导时间可视具体情况而定）；

　　收集沉淀：将诱导后的菌液在4℃条件下8000r/min离心15min，收集沉淀。加入0.01mol/L pH7.2的PBS洗涤离心后，再收集沉淀；

　　重悬蛋白：将沉淀反复快速冻融3-4次，用PH8.0的 Buffer A重悬。然后冰浴中超声波破碎至溶液不再粘稠后，混匀静置10min，4℃条件下8000r/min离心10min，收集上清备用。

　　GST融合蛋白的纯化步骤

　　① 细胞裂解物与50 %谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，室温轻摇使其吸附蛋白30min；

　　② 4℃，2100r/min条件下离心5min，弃上清，取样进行SDS-PAGE;

　　③ 沉淀中加入10倍标准体积的PBS后，颠倒混匀，洗去未结合的蛋白；

　　④ 4℃，2100r/min条件下离心5min，弃上清，取样进行SDS-PAGE;

　　⑤ 重复步骤③、④至少2次；

　　⑥ 将蛋白置于-20℃保存或用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱GST融合蛋白。

　　洗脱步骤如下：

　　沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min；

　　4℃，2100r/min离心5min，取上清；

　　重复以上两步骤2次，合并3次的上清。

　　蛋白浓度的测定

　　用紫外分光光度计测定纯化蛋白样品在260nm和280nm波长的光吸收值，按照下式计算样品中蛋白质含量。计算公式：蛋白质浓度（mg/mL）=（1.45×A280-0.74×A260）×稀释倍数。

　　GST蛋白纯化常见问题及建议

　　目的蛋白结合效率低或不结合

　　裂解方式：过分的裂解会使标签蛋白变性，阻止其结合

　　建议：在裂解过程中调节合适的超声功率和间隔时间或采用温和的机械/化学裂解方法。

　　缓冲液条件：谷胱甘肽-琼脂糖树脂在pH值低于6.5或高于8.0时，结合效率会降低

　　建议：使用前需用pH为6.5~8.0的PBS进行平衡。

　　蛋白发生变性或聚集

　　建议：使用前需用pH为6.5~8.0的PBS进行平衡。

　　建议：可在裂解前加入1-10mM的DTT，在缓冲液中也加入DTT；蛋白-核酸结合或蛋白-蛋白结合可加氯化钠。

　　蛋白或脂类在介质中聚集

　　建议：及时清洗介质或更换新的介质。

　　上样过程：上样量过载与上样流速过高均会影响GST标签蛋白的结合

　　建议：在上样过程中要注意控制上样量与保持低流速。

　　GST 融合蛋白发生聚集沉淀

　　建议：在裂解Buffer和其他缓冲体系中加入DTT

　　GST融合蛋白被过度稀释

　　建议：重新浓缩样品，增加蛋白浓度。

　　目的蛋白洗脱不下来或洗脱率低

　　洗脱条件

　　建议：可以通过加大洗脱液体积、降低流速以及延长洗脱液的保留时间等措施提高洗脱效率。

　　样品没有经过前处理

　　建议：样品上柱前必须要经过离心或过滤。

　　非特异性吸附

　　建议：适当选择添加剂降低非特异性吸附。

　　洗脱缓冲液中谷胱甘肽被氧化

　　建议：洗脱缓冲液需现配现用，另外可以尝试加入1-5mM的DTT。

　　洗脱蛋白有杂质

　　GST融合蛋白被蛋白酶部分降解

　　建议：加入蛋白酶抑制剂PMSF。注：丝氨酸蛋白酶抑制剂必须在使用凝血酶或凝血因子Xa 前除去。

　　GST融合蛋白被蛋白酶部分降解

　　建议：使用蛋白酶缺陷型菌株lon-或ompT，或ompT和lon双缺陷型菌株。