一、资料

　　（一）仪器1.净化作业台2.离心机3.恒温水浴箱4.冰箱（4℃、-20℃、-70℃）5.倒置相差显微镜6.培育箱7.液氮冰箱

　　（二）玻璃器皿1.吸管（弯头、直头）2.培育瓶3.玻璃瓶（250ml、100ml）4.废液缸

　　（三）塑料器皿1.吸头2.枪头3.胶塞4.移液管（10ml）5.15ml离心管6.冻存管（1～2ml）

　　（四）别的物品1.微量加样枪2.红血球计数板3.记号笔4.医用橡皮膏5.移液枪

　　（五）试剂1.D-Hanks液2.小牛血清3.培育液4.双抗（青霉素、链霉素）5.胰蛋白酶（0.08%）6.1NHCl7.7.4%NaHCO38.DMSO（剖析纯）或无色新鲜甘油

　　二、操作过程

　　（一）细胞冻存

　　1.制造含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培育液；

　　2.取对数成长，期的细胞，用胰蛋白酶把单层成长的细胞消化下来，悬浮成长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；

　　3.离心1000rpm，5min；

　　4.去掉胰蛋白酶及旧的培育液，参加适当制造好的冻存培育液，用吸管悄悄吹打使细胞均匀，计数，调理冻存液中细胞的终密度为5×106/ml～1×107/ml；

　　5.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；

　　6.在冻存管上标明细胞的称号，冻存时间及操作者；

　　7.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

　　（二）细胞复苏

　　1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快消融。

　　2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培育液，混匀；

　　3.离心，1000rpm，5min；

　　4.弃去上清液，参加含10%小牛血清培育液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培育瓶，37℃培育箱静置培育；

　　5.次日更换一次培育液，持续培育。

　　三、注意事项

　　1．从增殖期到构成细密的单层细胞曾经的培育细胞都可以用于冻存，但好为对数成长，期细胞。在冻存**好换一次培育液；

　　2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护作业，避免**；

　　3．冻存和复苏好用新制造的培育液。