一、细胞复苏

　　将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移人15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM完，全培养基，轻轻吹匀，离心，2000rpmX2min，弃上清液。

　　加入10mlDMEM培养基清洗，弃上清液。加入10mlDMEM完，全培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5%CO2的细胞培养箱中培养。

　　二、细胞传代

　　细胞密度达到80%~90%时．去培养基，10mlPBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加人1mlDMEM完，全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。

　　加入10mlPBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。再加入10mlPBS（经高压灭菌，保存于40C），吹匀，吸取10微升进行计数，按照1×106/盘接种，在含5%CO2的细胞培养箱继续培养。

　　三、细胞冻存

　　细胞密度达到80%～90%时，去培养基，10mlPBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加入lmlDMEM完，全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10mlPBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。

　　加入lml冻存液（90%血清，10%DMSO），放入冻存盒内（盒内有异丙醇，以保，证温度降低的速度），立即放入一80℃冰箱内，过夜，第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。

　　冻存液的配制：70%的完，全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

　　注意事项

　　（1）进入细胞间开始细胞培养时，必须严格按照下列步骤操作：

　　①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。

　　②确定衣服的袖口已经卷起或者白大褂的袖口已经扎紧。

　　③确定酒精灯内的酒精量，需要的话及时进行补充。

　　④确定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。为了方便单手开启瓶盖，实验开始可以把所有瓶盖旋松。

　　⑤尽量不要直接倾倒溶液，除非瓶口没有被烧坏。如果倾倒失败，溶液粘在瓶口，请用喷过75%酒精的纸巾仔细清洁瓶口周围（不要接触到瓶口）后在火焰上简单烧灼。

　　⑥操作时如果不能肯定所用的耗材是洁净的，必须及时更换。

　　⑦实验完毕及时收拾，保持工作区域清洁整齐，，后用75%酒精清洁台面。

　　（2）细胞污染的预防

　　①实验用品防止污染。细胞培养所用试剂、耗材、器材的清洗、消毒要彻，底，各种溶液灭菌要仔细，并在无菌实验检测阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁、消毒、灭菌。

　　②操作过程防止污染。

　　③穿着容易起静电或吸附灰尘的衣物必须更换为白大褂后才能进入细胞间。

　　④实验开始需要确定戴的手套没有问题，只要接触过生物安全柜之外的物品，必须及时对手套进行消毒。

　　⑤进入细胞培养间后关好门，坐下来尽量少走动以免影响生物安全柜的风帘。工作开始要先用75%酒精棉球擦手和瓶盖。事先要严格检查所用的器材、溶液和细胞，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大规模污染。

　　⑥细胞操作时动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口放在火焰周围简单转动烧灼，注意不要让火焰把塑料瓶口烧化。