培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。

　　1、贴壁细胞的传代

　　具体操作如下：

　　1.1、传代前准备：

　　预热培养用液：把装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。用75％酒精擦拭双手和经过紫外线照射的超净工作台。正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。点燃酒精灯：注意火焰不能太小。准备好将要使用的已灭菌的空培养瓶。取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。从培养箱内取出细胞，注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞，并做好记录。细胞培养瓶经用75％酒精擦拭后，再放入超净台。

　　1.2、胰蛋白酶消化：

　　将瓶盖过酒精灯火焰消毒后，打开瓶盖，靠近酒精灯，小心吸出旧培养液，用PBS清洗2－3次，沿壁（无细胞的一面）缓缓加入适量消化液（胰蛋白酶液），轻轻摇晃。注意消化液的量以盖住细胞Z好，Z佳消化温度是37℃。显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。

　　1.3、吹打分散细胞：

　　弃去大部分消化液（仅留少量在瓶内），并轻轻拍打培养瓶，使细胞分散，然后加入新鲜的培养液，

　　再用吸管轻轻吹打成细胞悬液（尽可能不要出现泡沫，否则对细胞有损伤〕

　　1.4、分装稀释细胞

　　将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。将培养基放入显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。Z后在瓶上做好标记，如细胞代数、日期及姓名等。

　　1.5、继续培养：

　　用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在

　　瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。

　　2、悬浮细胞的传代

　　悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉，只留下少量，然后加入新鲜培养液即可。 当细胞悬液中碎片或颗粒物较多，感觉到比较脏时，可以将悬液移到离心管内，1000～1500rpm离心3分钟，弃上清，加入约2ml培养液，吹打至均匀，滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中。然后置于二氧化碳培养箱中培养（拧松培养瓶盖）。