ELISA实验看似简单，要成功还真是不容易。经历过无数次失败的教训，做ELISA还是需要多多总结，避免类似问题再发生。

以下是小编为大家整理出来的ELISA实验常见问题

l颜色背景深/非特异性染色

l所有孔均无明显颜色

l标准曲线不佳

问题一：背景颜色深/非特异性染色

l没有充分清洗酶标板：确保清洗过程中每个微孔所加入洗涤液量一致，清洗完成后，将酶标板用力按压在吸水纸上，以除去残余的液体，重复2~3次。

l错加其他试剂：实验前应检查试剂，确认试剂均对应试剂盒。

l孵育时间/显色时间过长：按照说明书控制时间。

l吸头被酶标记物污染或微孔被阳性对照污染：吸取不同日试剂时应更换吸头，操作时使用移液器，减少污染的可性。

l抗体浓度过高：按要求进一步稀释后再使用。

l底物在使用前曝光或污染：底物应始终避光保存。

l使用了错误的滤镜片：校正相应波长后再读取吸光值。

问题二：所有孔均无明显颜色

l组分试剂混淆使用：配制或使用时应看清标签。

l酶标物受污染失活失去催化显色能力：确认盛酶标的容器不含酶抑制剂，确认配制洗液的容器已洗干净。

l遗漏了某种试剂或步骤：严格审阅操作步骤。

l试剂盒超过有效期或储存不当：在有效期内使用，并按照说明书的保存条件保存，避免污染。

l试剂、样品用前未平衡：所有试剂、样品应置室温平衡30分钟左右。

l孵育反应时间不足/显色反应不足：按照说明书控制时间。

l洗涤次数过多，浓缩洗液稀释倍数不符合要求：将洗涤次数控制在2~3次，按说明书要求稀释洗液。

l蒸馏水水质有问题：配置好的洗液一定要检测PH值是否呈中性。

l读取吸光值时使用了错误的滤光片：确认波长后再读取吸光值。

问题三：标准曲线不佳

l标准品配制有误：严格按照说明书标准品配制进行操作。

l试剂盒储存方法不当或储存环境太差：请在说明书的条件下保存，不要将重悬后的组分在室温放置时间过长。

l过早稀释各组分：各工作组分请在使用前几分钟配置，并立即加入微孔中。

l加入样品后未混匀：加入多种样品后在混匀器上充分混匀，防止产生不溶物。

l洗涤不正确：洗涤液要注满各孔，但不能溢出。洗板机洗板时不应有遗漏，洗涤应充分。

l液体过多残留于孔壁上：加液时，吸头在不碰到孔底的前提下尽量沿着孔壁下方加液。

l器材重复使用：吸取不同的试剂时应更换吸头，配置不同的试剂组分时，应使用不同的器皿。

l阈值附近阴阳性不稳定：同一样品做3个复孔，以2个（含2个以上）相同结果为准。