本文主要介绍4种Transwell实验的实验步骤，具体包括：Transwell肿瘤细胞迁移实验、Transwell上皮细胞培养实验、Transwell B16细胞的体外迁移实验、Transwell内皮细胞HMEC-1迁移实验。

　　一、Transwell肿瘤细胞迁移实验

　　过程与Transwell侵袭实验基本一致，不同的只是不需要铺Matrigel。由于没有基质胶的阻挡，细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大。我做侵袭实验的细胞密度是1×105，而迁移实验的密度是1×106。另外，下层培养液的FBS浓度也可适当下调，侵袭实验的浓度是5%，迁移实验的浓度是2.5%。

　　二、Transwell上皮细胞培养

　　1. 将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV、100 U/mL青霉素和100µg/mL链霉素、无Ca2+、无Mg2+、无血清的MEM。

　　2. 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞。

　　3. 离心后立即用新鲜的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5％胎牛血清、100 U/mL青霉素和100µg/mL链霉素的LHC-8 medium冲洗一次。

　　4. 冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90％，则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12mm），以37°C，5％CO?-95%空气，含5%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100µg/mL链霉素的LHC-8 medium孵育6~10天。

　　5. 孵育后，经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间，即可用于电生理试验。显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片。

　　三、Transwell B16细胞的体外迁移实验

　　首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8µm）的下表面涂一层fibronectin(10 µg/mL，50µL)，37度2小时，PBS洗一遍后，放入预先每孔加有600µL的培养基（含10%血清）的24孔板内，后在Transwell的内室加入细胞（100µL，用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度），放入培养箱，12-18小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞，另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。

　　四、内皮细胞HMEC-1迁移实验

　　1%明胶处理的Transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后，上室加入100µL用serum-free MCDB131稀释的5×10?/孔的HMEC及不同浓度的药物，下室加入0.6mL serum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激迁移，同时设置相应阴性及阳性对照，置于CO?培养箱中作用8小时，然后弃去孔中培液，用90%酒精常温固定30分钟，0.1%结晶紫常温染色10分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜下观察并拍照，最后用10%乙酸100µL/孔抽提10分钟，于600nm处测定OD值。抑制率计算公式为：抑制率（%）=[(OD值给药组-OD值无刺激阴性对照)/（OD值不加药阳性对照-OD值无刺激阴性对照)]×100%。