高盐（4% NaCl）饮食--HSD（High-salt diet ）已被确定为炎症反应相关的有效免疫调节剂。最近的研究发现，HSD加剧溃疡性结肠炎和自身免疫性脑脊髓炎的组织炎症，并增加心血管疾病的风险，这与辅助性T细胞17(TH17)增强的发育和功能有关。其他研究报道HSD使巨噬细胞极化为M1表型，并与干扰素-(IFN)反应升高有关。一项对健康人类参与者的纵向研究发现HSD和单核细胞频率之间存在很强的相关性。HSD可能作为一种炎症触发器，克服与肿瘤微环境相关的免疫抑制条件，如免疫检查点抑制剂的表达和主要组织相容性复合体I (MHC-I)分子的下调。最近的研究表明HSD可以抑制肿瘤的生长，这可能依赖于骨髓源性抑制细胞(MDSCs)。

　　近日，一项以小鼠为模型的研究指出，当肠道微生物刺激免疫细胞时，高盐的饮食能抑制肿瘤的生长，同时，这为将来提供了可能的治疗途径。相关研究结果发表在2021年9月10日的《Science Advances》期刊上，论文标题为“High-salt diet mediates interplay between NK cells and gut microbiota to induce potent tumor immunity”。

　　HSD对肿瘤免疫的同时未表现明显副作用

　　作者研究了盐对小鼠B16F10（皮肤黑色素瘤，简称B16)的影响。为此,在给小鼠植入B16后喂食了三种不同剂量的盐。作者发现，与正常饮食（ND）相比，HSD喂养的小鼠肿瘤进展显著降低了，总体存活率增加了(图1B-C)。在喂食低盐饮食（LSD）的小鼠中，没有发现明显的肿瘤消退(图1B-C)。喂食水和普通食物的小鼠肿瘤没有明显的变化。进一步验证发现，与健康(H)对照组相比，黑色素瘤小鼠的血清Na+水平在终点降低了约35%，而用HSD喂养的小鼠的血清Na+恢复到了正常水平。

　　作者评估了HSD喂养的荷瘤小鼠相关的生理和器官特异性损伤风险。结果表明，HSD对脑、结肠癌、心脏、肾脏、肝脏、肺、脾等器官没有毒理学影响。另外，作者发现HSD喂养的小鼠对B16肺转移具有强大的肿瘤免疫能力，肺灶计数下降约35%。总之，作者的数据表明HSD提供强大的肿瘤免疫，而对正常生理没有明显的副作用。

　　NK细胞驱动的IFN对HSD介导的肿瘤免疫至关重要

　　为了了解ND和LSD相对于HSD喂养的黑素瘤C57BL/6小鼠的免疫反应的变化，作者对肿瘤浸润的免疫细胞、引流淋巴结和脾细胞进行了广泛的免疫细胞分析。发现HSD饮食导致小鼠的NK细胞有50%以内的上调，而ND和LSD小鼠则没有明显改变。此外, HSD喂养的小鼠的其他主要免疫细胞群(CD4+和CD8+ T细胞、γδT细胞、巨噬细胞、肿瘤浸润免疫细胞MDSCs)的频率变化最明显(图2)。

　　相比ND，HSD喂养B16 RAG1−/−白鼠显示，肿瘤体积4倍减少，生存质量得以改善(图2B-C)。此外，流式细胞术分析显示，与ND相比，HSD喂养的B16 RAG1−/−小鼠肿瘤浸润免疫细胞中NK细胞的频率更高，同时NK细胞上CD107a表达增加，程序性死亡受体1（PD1）表达降低(图2D-E)，IFN在NK细胞中也显著上调，TNF水平略微升高(图2F)。此外，与使用ND组相比，使用HSD组的B16小鼠黑色素瘤细胞中细胞程序性死亡-配体（PDL1）的mRNA表达明显降低。为了进一步确定NK细胞在HSD诱导的肿瘤免疫中的作用，作者在HSD喂养的带有B16 RAG1−/−小鼠中使用抗小鼠NK1.1抗体耗尽NK细胞(图2H)。结果，NK细胞的消耗减弱了HSD对B16生长的保护作用(图2I)。进一步研究显示，HSD诱导的肿瘤免疫是由NK细胞和IFN的产生介导的。

　　盐诱导血马尿酸盐水平升高的血清代谢组学改变

　　作者比较了与健康（H）、肿瘤（T）和肿瘤+高盐喂养（T+HSD）组相关的小鼠代谢组学变化。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)数据鉴定出157个总代谢物中有87个被显著调节(图3A-B)。H、T和T+HSD的主成分分析(PCA)图显表明这三个组具有独特的代谢组学特征(图3C)。代谢组学结果显示，HSD喂养的B16小鼠的马尿酸盐、5-羟基吲哚乙酸、胆酸、酮戊二酸、l-谷胱甘肽氧化、尿糖酸等变化显著(图3D-E)，且相互之间具有良好的相关性。总之， HSD导致了马尿酸盐的增加。

　　盐强化抗PD1治疗与肿瘤消退

　　作者推测HSD摄入诱导血清马尿酸盐水平升高可能有助于抗PD1治疗。为了验证这个假设，作者让携带B16黑色素瘤的小鼠接受次优（SO）剂量的抗PD1联合LSD治疗（这两种药物对肿瘤生长没有保护作用）。发现，当LSD与抗PD1(SO)联合使用时，对B16黑色素瘤有很强的抑制作用图（4A-C)。这种抑制伴随着肿瘤浸润性免疫细胞NK细胞表面PD1表达的抑制，而LSD单独或单独抗PD1(SO)组没有观察到变化(图4D)。因此，说明盐可以作为辅助剂来促进抗PD1免疫疗法的肿瘤消退。

　　肠道微生物群对HSD介导的肿瘤免疫至关重要

　　为了探索肠道微生物组对HSD介导肿瘤免疫的作用，作者使用抗生素消耗小鼠的微生物组，称为抗生素诱导微生物组消耗(AIMD)小鼠。结果表明，HSD喂养的小鼠在野生型微生物菌群(WT)中抑制了肿瘤的生长，但在AMID小鼠中没有(图5B)。进一步研究发现，HSD喂养对WT B16小鼠比HSD喂养对AMID小鼠活得更好(图5C)。此外，流式细胞术对肿瘤浸润免疫细胞的分析显示，HSD喂养的WT小鼠中NK细胞的频率增加，NK细胞的激活(CD107a)和抑制(CD96)标记物分别被上调和下调，而在HSD喂养的AMID小鼠中则没有这些表现(图5D-E)。

　　因为肠道菌群的消融会导致HSD诱导的肿瘤免疫功能的丧失。作者推测HSD相关的肠道微生物多样性变化可能在NK细胞激活和肿瘤免疫功能中发挥作用。作者对H组、T组和T+HSD组的粪便样本进行16S核糖体RNA (rRNA)宏基因组分析。Simson和Shannon多样性图显示，与H和T组相比，T+HSD组的微生物群落多样性丰富度和均匀度均有所增加(图5G)。综合数据表明双歧杆菌可能是HSD介导的肿瘤免疫因素之一。

　　HSD喂养小鼠的粪便微生物区系移植（FMT）可使肿瘤消退

　　将HSD喂养的小鼠的粪便通过灌胃转移到AIMD小鼠体内。然后将这些小鼠植入B16细胞，并在ND上维持以监测肿瘤的生长(图6A)。结果发现，与FMT的ND小鼠（NR）相比，FMT的HSD小鼠(R)的肿瘤体积和质量显著(~42%)下降，存活率提高，NK细胞的频率明显较高(图6)。并且观察到由CD107a表达增加，干扰素和TNF水平增加导致的NK细胞功能增强(图6 F-G)。接下来，为了了解FMT对R和NR小鼠肠道菌群的影响，作者采用基于定量聚合酶链反应(qPCR)的粪便标本进行菌属富集分析。结果显示，与NR相比，R的粪便样品中双歧杆菌的含量上调了2.5倍，而在其他主要菌属中没有明显变化(图6H)。此前已有报道称，苯甲酸-甲戊酸途径的副产物之一是马尿酸盐。苯甲酸-甲戊酸途径是双歧杆菌重要的代谢途径。因此，推测肠道双歧杆菌增多可能是通过分泌血清马尿酸盐影响NK细胞水平和肿瘤免疫。

　　HSD导致肠道通透性增加和双歧杆菌瘤内定位

　　小鼠皮下注射B16黑色素瘤，并喂食正常饮食ND、低盐饮食LSD或HSD，通过Evan’s blue排除和异硫氰酸荧光素(FITC) -葡聚糖肠道通透性试验。作者发现，与喂养LSD、ND小鼠相比，HSD喂养的B16小鼠肠道通透性增加了约2倍(图6A和7A)。作者进一步测试了携带肿瘤的WT和RAG1−/−小鼠的肠道通透性，并观察到与健康对照组或喂食ND的B16小鼠相比，HSD增加了RAG1−/−和WT小鼠的肠道通透性(图7B)。

　　为了验证肠通透性增加，可能导致肠道双歧杆菌逃逸并在喂食HSD的B16小鼠的黑色素瘤中定植。为了验证这一假设，作者对喂食HSD的B16小鼠的肿瘤组织中双歧杆菌进行了qPCR分析，结果发现HSD喂养的小鼠黑色素瘤中双歧杆菌丰度比ND喂养的小鼠黑色素瘤中双歧杆菌丰度增加了6倍，这表明在黑色素瘤肿块中存在双歧杆菌(图7C)。这些数据进一步提高了NK细胞与双歧杆菌直接交流的可能性。作者发现，在有或没有NK刺激细胞因子(IL-2 + IL-12)的环境下，随着双歧杆菌的剂量增加，双歧杆菌与脾细胞体外共培养可将NK细胞的增殖及其频率上调两倍(图7D)。进一步分析发现，双歧杆菌增加了NK细胞IFN和穿孔素的表达，但没有增加IL-17A的表达(图7E-G)。作者因此推测，在肿瘤微环境中引入双歧杆菌可能复制了双歧杆菌的体外效应，并可能导致NK细胞上调和肿瘤免疫，即使在没有HSD的情况下也是如此。作者发现，接受双歧杆菌瘤内注射的ND小鼠在肿瘤消退和总存活率以及NK细胞反应增加方面与HSD喂养的小鼠相比相当(图7H-L)。此外，当NK细胞被抗鼠NK1.1抗体耗尽时，双歧杆菌给药的效果减弱（7H-L)。接下来，作者分析了注射双歧杆菌的小鼠的血清代谢产物谱，发现与没有接受瘤内双歧杆菌的荷瘤小鼠相比，双歧杆菌在肿瘤内定植后，马尿酸盐水平显著上调（图7M-O)，表明双歧杆菌与NK细胞之间通过马尿酸盐的相互作用对HSD肿瘤免疫至关重要。

　　总结

　　1933年，Shear发表了第一篇综述，认为Na+和K+在体外对癌细胞生长具有调节作用。最近的研究表明，HSD对肿瘤有保护作用。在本研究中，作者的工作可以概括为以下几个方面。HSD喂养黑色素瘤荷瘤小鼠，能诱导NK细胞介导的肿瘤免疫、增加存活率，伴随PD1表达下调、IFNγ和血清马尿酸盐上调；低盐饮食能增强非最佳剂量的抗PD-1治疗的抗肿瘤效果；抗生素处理会削弱HSD的抗肿瘤作用，移植HSD喂养小鼠的粪菌能恢复与NK细胞功能相关的肿瘤免疫；HSD提高双歧杆菌丰度，同时增加肠道通透性，导致双歧杆菌移位至肿瘤内，从而增强NK细胞功能；瘤内注射双歧杆菌能活化NK细胞，从而抑制肿瘤生长。

　　原文链接：

　　https://www.science.org/doi/epdf/10.1126/sciadv.abg5016