我最近一直在进行大量的应用程序开发，并且不得不“实践我所宣扬的”。我们这些流式细胞仪领域的人，尤其是核心设施中的那些人，喜欢强调流式细胞仪的所有注意事项，但我们中有多少人（最近）在完善染色分析的所有复杂性中挣扎。我必须说，当我第一次同意为调查员制定一些协议时，我有点漫不经心。染色方案并不新颖或困难，只是我个人已经有一段时间没有做过一些检测了。当我经历这个过程时，我想，嘿，这并不像人们想象的那么简单……而且我已经这样做了很长时间了。我只能想象当他们的 PI 建议他们使用这项技术来调查他们的假设时，一个对流式细胞术作为一种技术的全新的人的感受。所以，我可以带着一些信念提出我成功进行心流实验的前 10 个步骤，因为我现在已经穿上了你的鞋子。

　　我真的很想进入前 10 名，但尽我所能，我只能将其减少到 11 名。

　　10成功流式细胞术实验的 11 个步骤

　　1.阅读大量协议（不仅仅是试剂制造商的协议）。  面对现实吧。如果你问十几个人如何制作花生酱和果冻三明治，你最终会得到 12 种不同的食谱。FCM 协议也是如此。每个人都发现协议的不同部分值得强调。如果您阅读其中的一些，您可以开始将整个故事放在一起。

　　2.了解哪种颜色最适合您的乐器。  当您使用具有几个不同平台的核心设施时，这可能是一个更大的问题。让我直接告诉你，没有两个细胞仪的功能是相同的，甚至没有两个相同型号的细胞仪。如果您有幸拥有流式细胞仪核心和知识渊博的员工，请务必询问他们最喜欢的 4、5 或 6 色面板是什么。他们还应该能够告诉您给定仪器上某些颜色的限制可能是什么。

　　3.在设计面板时，寻找最大亮度和最小溢出。  好的，假设您知道要运行哪种抗体，并且就硬件而言，您知道在您的机构中可用的抗体。有趣的来了。你有一份抗体清单和一份荧光染料清单——你如何匹配它们？您可能听说过这句古老的格言，将暗淡的荧光染料放在针对丰富抗原的抗体上，将明亮的荧光染料放在针对稀疏抗原的抗体上。除此之外，您还希望最大限度地减少溢出——来自被同一激光激发且发射重叠的探针的荧光。溢出 = 背景，背景 = 分辨率降低。这需要一些努力和一些专业知识，因此请咨询您友好的流程大师寻求帮助，或尝试一些旨在帮助完成此过程的新实用程序（即CytoGenie来自 Woodside Logic 或来自 Treestar 的Fluorish）。

　　4.滴定您的试剂。  做什么的？制造商告诉我每次测试使用 5ul（通常 100ul 体积中有 10^6 个细胞）。在不追随试剂制造商告诉您使用过多抗体以浪费抗体并不得不购买更多抗体的阴谋论潮流的情况下，我会说我发现制造商建议稀释的次数太多了集中。

在适当的位置对固定的人 PBMC 进行 CD4 染色

　　滴定浓度（左）和制造商的

推荐浓度（右）。

　　5.  概述你的攻击计划。  为您的协议制定详细的工作清单。通用协议有助于计划您的实验，但当需要执行分析步骤时，您确实需要一份工作清单。顾名思义，这是如何执行协议的分步配方。我通常包括步骤、持续时间、试剂量、温度等……当您进行分析时，请记下大量笔记，以便您可以微调协议，添加更多细节。目标是能够将此工作清单和试剂交给另一个用户，他们应该有成功的结果。我喜欢在 Excel 中执行此操作并写入所有单元格公式，以便我可以输入需要染色的样本数量，并让它自动为我完成所有稀释。我还在底部总结了所需的缓冲区和数量。请参阅下面的示例。

　　6.  始终使用死细胞标记。 死细胞真的会搞砸分析。我保证您将进行的大多数实验都有一个颜色和检测兼容的死细胞标记。没有理由不使用死细胞标记，所以请，请这样做。它使情节看起来更好看，没有它你真的不能做好的（暗淡的）双正枚举。

不使用上游死细胞的两参数图

标记（左）和去除死者后的相同图

细胞（右）。注意对角线人口的扩展

出负人口（被一个地区包围在左图中）

　　7.  将您的 FMO 设置为单独的实验，而不是在您的真实样本上。  我不会讨论使用 FMO 控件（F luorescence Minus O ne）的优点，让我们假设您知道这几乎是必需品。我要说的是，如果您在使用珍贵样本的那天尝试设置 FMO 控制，您可能会忘记它，或者因为您认为您没有足够的细胞而忽略它。因此，如果可能，请在另一天提前设置您的 FMO 控件，以便您可以花时间正确设置所有内容。如果您有足够的样本，每次都包含它会很好。

　　8.使用珠子进行补偿控制。  我非常提倡使用捕获珠来设置补偿。这真的是一个没有道理的事情。我以前写过关于这个主题的文章。即使您的单染色对照在细胞上看起来很好，我仍然会使用珠子，因为它们总是一致的。

　　9.  缓慢采集样本以达到最大分辨率。  如果您在完善染色程序时遇到麻烦，现在不是搞砸的时候。在以流体动力学为重点的仪器上，您需要浓缩样品并缓慢运行，以保持较窄的核心流并获得最佳分辨率。如果您使用的是另一种类型的流通池（例如 Millipore 毛细管或 Attune 等声学聚焦系统），您应该更关注由于洗涤不充分而导致的背景增加，而不是宽样品芯。

　　10.  用几种不同的方式分析你的数据。  即使我对如何进行分析有一个清晰的想法，但我经常对我改变轴或向后开始的次数感到惊讶，并且发现我比旧方法更喜欢新方法。Backgating 是一种帮助识别稀有种群的方法，一直到其祖先。确保利用您的活细胞通道以及门控聚集体并去除可能存在荧光漂移的任何时间片。

　　11.   QC 您的仪器并创建一个特定于应用程序的 QA 协议。  科学不是一次性交易。如果它不可重现，那它就不是真实的。为了给您提供获得可重现数据的最佳机会，您需要尽量减少仪器造成的误差。质量控制和质量保证怎么强调都不为过。通过在特定应用的电压设置下运行磁珠等简单的操作，您可以确保仪器处于与上次采集这些样本时相同的状态。为此，我通常使用 8 峰珠组中的一个峰（实际上是峰 4）。在使用适当的电压设置采集样本后，我运行磁珠，为峰创建目标通道并将其保存为模板。下一次，我需要做的就是拨入电压以将珠子放入目标中。