先进的疗法包括多种旨在供人类使用的基于细胞和基因的治疗平台。许多细胞和基因疗法在改变各种疾病适应症的患者护理标准方面的非凡承诺推动了该领域的重大财务投资，许多产品现在正在通过临床管道走向市场批准。虽然已获批准的产品已经对患者产生了深远的影响，但新的科学进展、针对大适应症的临床进展以及不断发展和支持性的监管环境为这些疗法在未来提供了更大的机会。尽管取得了进展，但细胞和基因疗法的一个绊脚石是临床开发时间短、制造过程复杂、

　　支原体检测

　　该行业的一个重点领域是微生物测试，特别是针对支原体物种，它们是细胞培养物中最普遍的污染物之一。污染对接受细胞和基因治疗产品输注的患者构成潜在威胁，这就是为什么这些产品必须证明在临床评估和随后的商业转化中作为产品安全性的一部分不存在支原体。然而，传统的培养和指示剂检测方法被认为是支原体检测的金标准，需要大量样本和较长的孵育时间（长达 28 天），这通常会超过新鲜产品的保质期（非冷冻保存的 24-48 小时）产品），甚至超过了冷冻保存产品的患者给药时间。这种冗长的周转时间与需要测试结果来告知进行或不进行治疗决策的需求不一致。快速微生物学方法，如核酸扩增技术 (NATs)，优先获得监管部门的批准，由于其样本量要求较低、易于使用、灵敏度和快速的周转时间。与通常外包给专业合同检测实验室的传统支原体培养检测不同，基于 NAT 的快速支原体检测方法正在内部实施。内部快速支原体检测使开发人员能够实现这些方法为当天的周转时间、增加控制以及通常降低成本提供的全部好处。越来越多的开发人员将其作为支原体检测的传统药典培养方法的替代品，因为它们的样本量要求较低、易于使用、灵敏度高且周转时间短。与通常外包给专业合同检测实验室的传统支原体培养检测不同，基于 NAT 的快速支原体检测方法正在内部实施。内部快速支原体检测使开发人员能够实现这些方法为当天的周转时间、增加控制以及通常降低成本提供的全部好处。越来越多的开发人员将其作为支原体检测的传统药典培养方法的替代品，因为它们的样本量要求较低、易于使用、灵敏度高且周转时间短。与通常外包给专业合同检测实验室的传统支原体培养检测不同，基于 NAT 的快速支原体检测方法正在内部实施。内部快速支原体检测使开发人员能够实现这些方法为当天的周转时间、增加控制以及通常降低成本提供的全部好处。与通常外包给专业合同检测实验室的传统支原体培养检测不同，基于 NAT 的快速支原体检测方法正在内部实施。内部快速支原体检测使开发人员能够实现这些方法为当天的周转时间、增加控制以及通常降低成本提供的全部好处。与通常外包给专业合同检测实验室的传统支原体培养检测不同，基于 NAT 的快速支原体检测方法正在内部实施。内部快速支原体检测使开发人员能够实现这些方法为当天的周转时间、增加控制以及通常降低成本提供的全部好处。

　　快速支原体检测资质

　　此前，我们将在此审查的出版物的作者能够成功获得加拿大卫生部的批准，以使用基于商业试剂盒（MycoTOOL 支原体检测扩增试剂盒；罗氏诊断）的终点 PCR 方法进行内部支原体检测。他们的间充质基质细胞 (MSC) 治疗产品用于 1/2 期骨关节炎临床试验 (NCT02351011)。该出版物的概述已在细胞培养皿上进行了审查，请参阅“内部快速支原体测试资格为细胞治疗产品发布测试提供了具有成本效益的快速周转解决方案”。实时 PCR 作为快速支原体检测的基础是一种有吸引力的解决方案，因为它比终点 PCR（无凝胶电泳步骤）耗时更少，检测动态范围更大（基因表达变化大于 2 倍）。此外，可以在检测中使用与细胞类型无关的恢复对照 (RC) 来减轻假阴性结果。

　　在他们最近发表在Cytotherapy（2021 年 11 月）上的论文中，实时聚合酶链式反应方法的内部缩写资格和在人间充质基质细胞中放大支原体检测的策略，商业上可用的实时 PCR 的可行性支原体试剂盒（MycoTOOL Mycoplasma Real-Time PCR Kit；Roche Diagnostics）被用于他们评估其研究性 MSC 产品的内部方法，使用与终点 PCR 方法证明成功的相同鉴定策略。

　　在患者同意的情况下，通过实时 PCR 重新分析来自其先前临床试验 (NCT02351011) 的生物库骨髓来源的 MSCs (MSCs(M))，以对用于支原体检测的试剂盒进行简短的内部认证。Eur 博士支持精简资格策略的基本原理。指南（第 2.6.7 节），其中指出最终用户无需重复制造商执行的验证。因此，开发人员选择评估针对其应用的几个关键参数（检测限、耐用性和基质干扰），而不是执行深入的验证策略来验证商业试剂盒。作者还测试了手动样品制备试剂盒（QC 样品制备试剂盒；罗氏诊断）中包含的 DNA 载体聚腺苷酸（poly(A)）的使用，

　　检测灵敏度/检测限 (LOD)

　　由于试剂盒制造商已经针对一组 10 种支原体物种验证了 LOD，因此使用代表其应用的污染途径的两种支原体物种（M.arginini和M.hominis ）评估了 LOD。标准培养方法能够检测到或低于 10 个菌落形成单位 (CFU)/mL 的支原体，因此实时荧光定量 PCR 试剂盒必须表现出至少同等灵敏度的性能。来自三个供体的 MSCs(M) 加入 10 倍稀释的经认证的支原体 gDNA 参考标准（400 GCs/mL、40 GCs/mL、4 GCs/mL 和 0.4 GC/mL精氨酸分枝杆菌和 2400 GCs/mL、240人型分枝杆菌的 GCs/mL 和 24 GCs/mL)，LOD 由实时 PCR 在所有技术复制中检测到的最低支原体 gDNA 稀释度确定。在 95% 检测的严格标准下，对于精氨酸分枝杆菌和人型分枝杆菌，可接受的 LOD ≤40 GCs/mL（相当于 10 CFU/mL）和 ≤240 GCs/mL (10 CFU/mL) ，分别实现了。在 DNA 提取过程中未添加 (–) 和 (+) 的情况下测定的 LOD 表明，在提取过程中添加 poly(A) 可提高从较低细胞密度 MSCs(M) 样品中 gDNA 的回收率。

　　矩阵干涉

　　基质干扰或特异性是测定在存在基质成分的情况下检测靶标的能力的量度，基质成分构成测试样品中存在的可能干扰靶标扩增的任何物质。最终的细胞产物 MSCs(M) 和培养基代表了基质干扰的双重来源。为了分别测试来自细胞产品和培养基的基质干扰，用过的培养基（代表过程中的无细胞样品）和悬浮在 DPBS 中的 MSCs(M) 细胞（代表最终的细胞治疗产品配方）用于实时荧光定量 PCR 测定。

　　加入支原体 gDNA 的 MSC(M) 样品中的平均交叉点 (Cp) 值（由 LightCycler® 480 软件计算用于信号量化）用于评估基质干扰的存在。如果基质成分干扰测定，与未稀释样品相比，稀释样品中的 Cp 值预计会降低。添加和不添加 poly(A) 的不同 MSC(M) 稀释度证实了细胞或培养基不存在基质干扰。

　　测定坚固性

　　通过在不同日期测试重复样品来评估坚固性。从 18 次实时 PCR 运行（物种每次运行 9 次）分析的数据显示，精氨酸分枝杆菌和人型分枝杆菌的测定间 %CV<4 和测定内 %CV<3，符合可接受的标准所有运行的 %CV<5 代表可靠且可重复的测定。

　　成功的资格标准

　　总之，本文所审查的研究的作者发现，他们基于罗氏 CustomBiotech MycoTOOL 支原体实时 PCR 试剂盒的支原体方法符合之前作者加拿大卫生部批准的用于支原体检测的终点 PCR 试剂盒的最低资格标准。研究性 MSC 产品。该测定证明了稳健性，对两种常见的支原体物种的检测限为 10 CFU/mL，在测试条件下没有可检测到的基质干扰。此外，结果显示出与 MycoTOOL 端点 PCR 试剂盒相当的灵敏度，同时还提供了节省分析到数据周转时间（<6 小时与约 48 小时）时间的额外好处。同样，对添加 poly(A) 的评估表明，它的加入可以增强其低细胞数（≤45000 个细胞/mL）样品中支原体 gDNA 的提取。虽然尚未经过监管机构的审查，但作者预计，根据他们在端点 PCR 内部认证方面的经验，该检测方法可能是可以接受的。尽管每种鉴定方法都需要与适当的监管机构合作讨论并达成一致，其中每种产品都需要药典方法，但实时 PCR 方法方法的价值超出了测试低细胞密度样本的范围。这种方法为其他有兴趣将商业实时 PCR 试剂盒用于无细胞样本（例如病毒载体生产或原材料）的开发人员提供了一个起点。此外，

　　概括

　　用于细胞和基因治疗质量测试的快速微生物方法的验证和采用是一项重要的发展，它克服了传统药典培养方法所带来的限制。下一代 NAT 方法的敏感性和快速性可以在更短的时间内为患者的安全提供保证。此外，这些方法可以很容易地应用于过程测试，这对于获得有价值的过程洞察力和实施质量源于设计方法至关重要。监管机构已经表明他们愿意与细胞和基因治疗开发商合作，以探索合格的替代检测产品质量测试的道路。在经过适当验证后，过去监管机构对 MycoTOOL 支原体实时 PCR 试剂盒的接受支持了这一趋势。