免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是应用免疫学基本原理——抗原抗体特异性反应原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究。

　　免疫组化具有特异性强、敏感性高、定位准确、形态与功能相结合等多种优点，可应用于确定细胞类型、发现微小转移灶、了解分化程度、临床应用、肿瘤起源与分化 、指导治疗与预后等多个方面。根据抗原抗体反应和化学显色的原理，组织切片或细胞样本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与生物素、荧光素等标记的二抗反应，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而进行显色分析。IHC将免疫反应的特异性和组织化学的可见性巧妙的结合起来，借助荧光显微镜和电子显微镜的呈像和放大，在细胞和亚细胞水平检测各种抗原物质。这种实验的独特之处在于它既直观的显示了蛋白在组织及细胞或细胞亚结构的定位，又保留了组织样品的结构特征，广泛应用于生物医学研究及临床诊断中。当然，免疫组化的片子大家看起来很容易，所以这次我想从原理出发，捋一捋文献中的免疫组化结果图是怎么做出来的，相信大家会有一个新的认识。常见的免疫组化一般分为以下三类：

　　1、免疫荧光方法：该方法是最早建立的免疫组织化学技术，利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的响应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后，即会发出一定波长的荧光，从而确定组织中某种抗原的定位。此外，还可进行定量分析。该方法特异性强、灵敏度高、快速便捷，所以在临床病理诊断、检验中应用广泛。

　　2、免疫酶标方法：该方法是60年代发展起来的技术，基本原理是以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶物或具有一定电子密度的颗粒，通过电镜或光镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。该方法是定位准确、对比度好、染色标本可长期保存。目前，已衍生出多种标记方法，在病理诊断中广为使用的有：过氧化物酶-抗过氧化物酶法（PAP法）、卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法（ABC法）和链酶菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法（SP法）。

　　3、免疫胶体金技术：免疫胶体金是以胶体金这种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性物影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其它能特异性结合免疫球蛋白的分子做为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量分析。

　　那么染出来的免疫组化片子怎么进行分析放到文章中呢？

　　概括来说，免疫组化分析主要有两种方法，阳性着色细胞计数法和染色强度评分法。前者是在光学显微镜下，随机多个视野下计数阳性着色细胞；后者则是在下按染色强度和染色阳性范围评分，最终分数相加。但组织样品的病理学分析仍然是耗时且主观的程序，其中人工判断染色强度来评分，直接受到视觉偏差的影响。且阳性细胞计数往往不能自动化进行，导致免疫组化分析费时费力。因此常借助软件进行客观分析，得到更加直观和稳定的数据。最常用的就是大名鼎鼎的Image J。

　　阳性着色细胞计数法就是通过Image J对片子进行颜色处理，转为非黑即白的二值化图片，进而进行自动化计数，得到结果。染色强度评分法则是通过Image J将阳性细胞的平均灰度值（染色强度）和阳性面积百分比（染色面积）共同作为 IHC 测量指标，最终给出四种评分：High positive (3+),Positive (2+), Low Positive (1+) and Negative (0)。最后，我们来两张图看一下：

　　（Foxp3是Treg的主要调节因子，可用于鉴定Treg细胞；DAPI可与DNA强力结合，可用于观察阴性细胞，毕竟都有细胞核嘛）

　　那么这张图表达的意思就是不同浓度的药物对肿瘤微环境中的Treg细胞的影响，可以看到背景深蓝色为DAPI染色的阴性细胞，天蓝色为标记的Treg细胞，通过药物作用，肿瘤微环境中Treg细胞数量不等，右面柱状图表明进行了定量分析，也是具有统计学意义的。

　　这张图中，vehicle为注射生理盐水的对照组，rGDF11为注射药物的实验组，粗略一看，我们可能不能明确的看出来两组的差异，但是通过染色强度定量分析，发现实验组的pSmad2/3、p-c-Fos、nfatc1着色显著多于对照组，具有统计学意义。 其实我们在很多文章中往往看不到统计分析图，这是因为我们做免疫组化的目的不一样，有的可能只是为了证明通过实验条件某种蛋白是不是表达了，或者说这种蛋白只在某种细胞中表达（比如肿瘤细胞），此时单列出免疫组化图片足以说明问题。