染色质免疫共沉淀实验·原理

　　在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

　　染色质免疫共沉淀实验试剂· 器材

　　试剂

　　甲醛

　　甘氨酸

　　PBS

　　SDS Lysis Buffer

　　洗脱液

　　RNaseA

　　蛋白酶K

　　omega胶回收试剂盒

　　器材

　　离心管

　　超声仪

　　电泳仪

　　离心机

　　染色质免疫共沉淀操作方法

　　一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）

　　取出1平皿细胞（10cm平皿），加入37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。37℃孵育10min。

　　终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。450μl 2.5 M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。

　　吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

　　细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后1000rpm，离心5min，弃上清，12000rpm，离心1min，黄枪头套白枪头，将上清尽量弃净，收集细胞。

　　倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200μl含2x106个细胞。这样每100μl溶液含1x106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5x106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4x106个细胞。因此每管加入400μl SDS Lysis Buffer。将两管混在一起，共800ul

　　超声破碎：VCX750，25%功率，4.5s冲击，9s间隙。共14次。

　　二、除杂及抗体哺育（第一天）

　　超声破碎结束后，10 000r/min 4℃离心10min。去除不溶物质。

　　留取300ul做实验，其余保存于-80℃。

　　300μl细胞中，100μl加抗体做为实验组；100μl不加抗体做为对照组；100μl加入4μl 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M），65℃处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。

　　在100μl的超声破碎产物中，加入900μl ChIP Dilution Buffer和20μl的50xPIC。再各加入60μl Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃颠转混匀1h。

　　1h后，在4℃静置10min沉淀，700 rpm离心1min。

　　取上清。各留取20μl做为input。一管中加入1μl抗体，另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜（最低速度）。

　　三、检验超声破碎的效果（第一天）

　　取100μl超声破碎后产物，加入4μl 5M NaCl，65℃处理2h解交联。

　　分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

　　四、免疫复合物的沉淀及清洗（第二天）

　　孵育过夜后，每管中加入60μl Protein A 、Agarose/Salmon Sperm DNA，4℃颠转2h。

　　4℃静置10min后，700 rpm离心1min。除去上清。

　　依次用下列溶液清洗沉淀复合物。

　　清洗的步骤：加入溶液，在4℃颠转10min，4℃静置10min沉淀，700 rpm离心1min，除去上清。

　　洗涤溶液：（1）low salt wash buffer-洗涤一次（2）High salt wash buffer-洗涤一次（3）LiCl wash buffer-洗涤一次（4）TE buffer-洗涤两次

　　清洗完毕后，开始洗脱。

　　洗脱液的配方：100μl 10%SDS，100μl 1M NaHCO3，800μl ddH2O，共1ml。

　　每管加入250μl洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。

　　重复洗涤一次，最终的洗脱液为每管500μl。

　　解交联：每管中加入20μl 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M），混匀，65℃解交联过夜。

　　五、DNA样品的回收与PCR分析（第三天）

　　解交联结束后，每管加入1μl RNaseA（MBI），37℃孵育1 h。

　　每管加入10μl 0.5M EDTA，20μl 1M Tris.HCl（PH6.5），2μl 10mg/ml蛋白酶K。45℃处理2h。

　　DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100μl ddH2O。

　　PCR分析