CircRNAs的鉴定方法

　　1. RNA-seq

　　根据总RNA-seq数据，通过使用设计用于“无序”剪接的算法，已发现了各种环状RNA，如外显子、内含子、基因间cricRNAs，使用的方法包括find_circ、circRNA_finder、CIRCexplorer和CIRI等。然而，要从总RNA-seq数据集中准确定量circRNAs，往往需要较高的测序深度，建议至少进行100 bp的测序，以确保准确预测circRNAs。

　　目前，随着生物信息学的发展，circRNAs的分析可以通过ACSF、CIRCexplorer2、CIRI2、DCC、KNIFE和Uroborus这6种算法来完成。此外，像STAR这样的mapper能够注释更复杂的RNA序列排列，具有较高的准确性和速度，如chimeric和circRNA；BWA-MEM算法可以检测需要快速和低RAM要求的circRNAs。

图1. 使用BED注释的circRNAs

　　（Cooper D A, Cortés-López M, Miura P. Genome-wide circRNA profiling from RNA-seq data[M]. 2018.）

　　2. 微阵列技术

　　微阵列技术的应用是对于RNA-seq的一个补充，其可以消除RNA-seq分析的不确定性。当确保重现性和效率时，该工艺具有高度的针对性，无论杂交的类型如何，都可以使用相关的标准分析方法。

　　在最近的一项研究中，已经集成了87,935个circRNA序列，涵盖了circBase中迄今为止鉴定的大部分circRNAs。此外，该芯片检测到的大部分circRNAs可以通过RT-qPCR或RNA-seq进一步证实。

图2.微阵列技术分析cricRNAs

　　（Li S , et al. Briefings in Bioinformatics，2018.）

CircRNAs的检测方法

　　1. RT-qPCR

　　CircRNAs的RT-qPCR已被广泛应用于circRNAs的检测、验证，甚至定量。然而，利用qPCR检测假定的circRNAs并不能保证其存在，因为某些线性RNA通过连接位点共享相同序列。目前，专为扩展circRNAs反向剪接点 (BSJ)序列而设计的不同引物对circRNAs的扩增具有较高的特异性，且不针对线性RNA，可以直接、精确地检测和定量circRNAs。其中，总RNA被RNase R消化后，逆转录为cDNA，然后用发散和聚合的引物进行扩增。

　　图1.来自 pre-mRNA 反向剪接的 circRNA 生物发生示意图（上）和使用 circRNA 连接作为 PCR 扩增模板的不同引物设计示意图（下）

　　（Panda A C , Gorospe M. Bio-protocol, 2018.）

　　2. 微滴式数字PCR（ddPCR）

　　ddPCR是一种新的RNA精确定量技术，具有较高的灵敏度。之前的一项研究测试了ddPCR在circRNAs定量中的应用，并确定了circRNAs的稳定性，并将RT-qPCR与ddPCR进行了比较。据观察，RT孵育时间越长，circRNAs积累的PCR产物就越多，RT-qPCR定量circRNAs的准确性就越低。DdPCR可以克服这一缺点，代替qPCR用于circRNAs的定量。此外，有研究表明，在晚期肺癌患者中，血浆分泌性circRNA水平可用RT-ddPCR法检测。

　　3. Northern印迹法

　　有证据表明，northern印迹是分析circRNAs的金标准，有力地表明了假定circRNA的环状结构。严格来说，circRNAs验证通常要求northern印迹与其他工具相结合，如RNase R和RNase H处理。在RNase R(-)组中，circRNAs和线性mRNA都可以被检测到，而在RNase R(+)组中，由于线性mRNA消化，只能检测circRNAs的条带。

　　4. 荧光原位杂交（FISH）

　　结合碱性磷酸酶、荧光染料或抗原的寡核苷酸探针可用于观察固定细胞和渗透细胞中的circRNAs，如ISH中使用地高辛素。在之前的一项研究中，使用简单的smRNA-FISH协议测量了由相同基因位点产生并与重叠的非环状mRNA异构体共存的circRNAs。最重要的是，BSJ位点需要通过设计的杂交探针进行扩展。

　　图2.使用RNA FISH对circRNA CDR1as进行单分子检测

　　（Kocks C , et al. Methods in Molecular Biology, 2018.）

　　5.NanoString技术

　　NanoString，一种相对较新的数字计数技术，在没有任何酶反应的情况下，可以精确地定量线性mRNA。最近的研究发现，在设计了跨越环状RNA的特定反向剪接连接的颜色编码探针后，NanoString技术可以被用于检测来自细胞系和B细胞恶性肿瘤患者的高质量和低质量RNA样本中的circRNAs，是一种灵敏、特异、定量准确的方法。